QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
I. Giới thiệu tổng quan
1. Phạm vi áp dụng: Áp dụng cho Phịng thí nghiệm Nuôi cấy mô tế bào thực
vật
2. Đối tượng áp dụng: Áp dụng trên lĩnh vực Nuôi cấy mô tế bào thực vật, cây
lan Hồ điệp.
3. Đặc điểm, đặc tính
3.1. Giới thiệu về cây lan Hồ điệp
Lan Hồ điệp được phát hiện vào năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt
tên là Angcraecum Album. Năm 1753, Linne đổi tên thành Epidendrum. Đến năm
1825, nhà Thực vật Hà Lan định danh lại thành Phalaenopsis.
Hồ Điệp có trên 70 lồi và ngày càng được lai tạo ra nhiều giống Hồ điệp lai
(Doritaenopsis). Loài hoa này có xuất xứ ở miền Bắc Australia, Ấn Độ và các nước
Đông Nam Á như Philippines, Indonesia, bán đảo Đơng Dương. Cây có thể mọc ở xứ
nhiệt đới và đồi núi cao 2.000 mét nên vừa thích hợp khí hậu nóng ẩm lại vừa thích
hợp khí hậu mát, nhiệt độ trung bình từ 20 0C đến 300C, trong đó điều kiện khí hậu tối
ưu nhất cho việc ni trồng loài hoa này là từ 220C - 270C.
Hồ Điệp là loài cây đơn thân với thân ngắn, lá to, dày, lá mọc cách, các lá mọc
sát vào nhau. Hồ điệp trổ hoa dạng phát hoa, hoa nở lần lượt từ gốc đến ngọn, hai cánh
hoa cạnh tròn, cánh hoa sau khác cánh hoa kia gọi là môi (labelle). Môi thường có
hình thù và màu sắc đặc biệt. Phấn hoa dính nhau thành phấn khối, khi chín thì nắp của
bao phấn tróc và phấn khối được bày ra, sự thụ phấn xảy ra thường phải nhờ vào côn
trùng, khi trồng người ta phải gây sự thụ phấn nhân tạo. Cũng vì vậy mà hoa lan lâu
tàn do khơng thụ phấn được (Phạm Hồng Hộ, 1975). Thời kì nở hoa thay đổi theo
loài và thường nở trong vài tháng. Lan Hồ điệp có màu sắc rất đa dạng như trắng,
hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Hồ điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng, hoặc có
đốm to hay nhỏ...

1

Rễ bất định khí sinh mọc từ gốc của thân xuyên qua bẹ lá. Rễ nhiều và phân
nhánh, rễ mập, sự phân nhánh này tùy thuộc vào sự sinh trưởng của cây, rễ bám chặt
trên giá thể. Cây hút hơi nước trong khơng khí và những khống chất từ những cây mà
nó sống bám trên đó, màu xanh của rễ cho thấy chúng có hoạt động quang hợp (Võ
Thị Bạch Mai, 1996).
Sự tạo thành trục phát hoa sớm được phân biệt với sự phát triển của rễ. Sự xuất
hiện của đầu trục phát hoa tạo thành một khe thẳng xuyên qua bao vỏ lá, trục phát hoa
bên, đơn giản hay phân nhánh, mang hoa ở hai bên, hoa đính vào trục nhờ cuống hoa.
Trong khi ấy, sự xuất hiện của rễ được ghi nhận bởi một sự mở vòng tròn. Trong giai
đoạn trổ hoa, sự phát triển của cơ quan dinh dưỡng có phần bị chậm lại, nếu cây được
tưới nước và dinh dưỡng đầy đủ thì cây vẫn tiếp tục tăng trưởng tốt. Phát hoa có chiều
dài thay đổi rất khác nhau, tùy thuộc vào giống và chế độ chăm sóc. Các mầm ngủ của
phát hoa được bao bọc bởi những lá thu nhỏ, mỗi mầm sẽ phát triển thành chồi dinh
dưỡng hoặc sinh sản. Cây Hồ điệp khi nhiệt độ thấp sự tăng trưởng của cây chậm lại
để cảm ứng ra hoa. Đối với những giống Hồ điệp lai, giai đoạn trổ hoa khó có thể xác
định một cách chính xác (Võ Thị Bạch Mai, 1996).
3.2. Ni cấy in vitro tế bào thực vật
3.2.1. Giới thiệu nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa mơi trường xác định ở điều
kiện vơ trùng. Mơi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khống,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường.
Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá,
thân, hoa hoặc rễ. Trước kia người ta dùng phương pháp nuôi cấy tế bào và mô thực
vật để nghiên cứu về đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền và tác
dụng của các hóa chất đối với tế bào và mơ trong q trình ni cấy.
Ngày nay phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật đã hướng về những ứng
dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với các giống cây trồng. Các nhà thực vật học đã
áp dụng phương pháp này với mục đích sau.

2


 Tạo một quần thể lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí
nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm sốt được.
 Tạo được nhiều cây con từ mơ và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt
phấn, chồi phát hoa…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được.
 Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách cấy mô phân sinh ngọn.
Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học (Dương Công Kiên, 2002).
3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng in vitro thực vật
3.2.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình
thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy.
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo lồi và bộ
phận ni cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì
thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi. Môi trường thay đổi tùy theo giai đoạn phân
hóa của mẫu cấy. Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành
phần: Khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh
trưởng thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Khoáng đa lượng: Nhu cầu khống của mơ, tế bào thực vật tách rời không khác
nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung
cấp là nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sắt.
Khoáng vi lượng: là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ dưới 30 ppm,
gồm có: Fe, Cu, Mn, Zn, Mo, Bo… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi
cấy nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của
mô. Hàm lượng các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào môi
trường nuôi cấy và các đối tượng nuôi cấy.
Carbon và nguồn năng lượng: Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô,
tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối

không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào
mơi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất trong nuôi cấy in vitro
là glucose và sucrose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Tùy theo

3


mục đích ni cấy, nồng độ sucrose thay đổi từ 1 – 6% (w/v), thông thường nhất là 2%
w/v, tương ứng với 58,4mM (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng
trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến
dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở
thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều
nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin,acid nicotinic, pyridoxine và myo inositol. Thiamin
là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào.
Các hợp chất hữu cơ bổ sung không xác định: Bổ sung nhiều chất trích hữu cơ
khác nhau vào trong môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự
tăng trưởng của mô. Các chất bổ sung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết
nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua. Tuy nhiên các chất hữu
cơ không xác định này chỉ nên được sử dụng như là giải pháp cuối cùng và chỉ có
nước dừa và protein hydrolysate hiện nay được sử dụng rộng rãi.
Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác: mặc dù tế bào có khả năng
tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bổ sung các amino acid vào môi
trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Việc sử dụng amino acid
đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào và nuôi cấy tế bào trần. Amino
acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào
và nguồn nitrogen này được tế bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
3.2.2.2. Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy
Tuổi của cây: các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc

người ta thường dùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô. Khi cây già đi, khả năng
tái sinh của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như
trong trường hợp cây bụi. Một vài ví dụ cụ thể chỉ ra sự khác nhau về khả năng tái sinh
và phân chia tế bào giữa cây già và cây non in vitro: Hedera helix (Stoutemeyer và
Britt, 1965), Lunaria annua (Bajaj và Pierik, 1974) và Anthurium andreanum (Pierik
và cs., 1974). Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ
những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đôi khi
qua nhiều lần cấy chuyền, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng
4


tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như
Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị
Thủy Tiên, 2002).
Tuổi của mơ và cơ quan: Những mơ cịn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn
những mô cứng nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá
còn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn
nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những loài khác
nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa cịn non đơi khi tái
sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và ctv,
1974).
Tình trạng sinh lý: Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và
khả năng phân chia tế bào in vitro. Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn
sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ
tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb,
1957). Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đơng (cuối thu đầu đơng) khó ni cấy in
vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi
chúng bắt đầu phát triển).
Vị trí của mẫu cấy trên cây: Có sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh
trưởng và phát triển in vitro. Theo đó, những chồi ban đầu được tách từ những vị trí

thấp trên cây phát triển trong môi trường in vitro tốt hơn và chồi gốc tăng trưởng
nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương
được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra
tương tự đối với lily (Robb, 1957). Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ
những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá
đều có phản ứng in vitro giống nhau.
Kích thước mẫu cấy: Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mơ phân sinh
khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được
tách rời khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích
thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất
dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn
những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt mẫu bị tổn
5


thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái
sinh của các mẫu cấy từ vảy hành lily đã được chứng minh (Aartrijk, 1984).
Vết thương: Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trị quan trọng trong
sự tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh
dưỡng và các chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngồi ra, có thể
tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương.
Phương pháp cấy: Các mẫu cấy có thể được đặt trên mơi trường theo nhiều cách
khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực
(cắm phần ngọn xuống môi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu
được cấy không cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp
đầy đủ oxy nhưng những nhân tốt khác cũng đóng vai trị quan trọng. Phần gốc của
mẫu cấy khơng cực có các chất dự trữ khơng có khả năng khuếch tán vào trong agar
do nó khơng tiếp xúc với môi trường. Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ
Amaryllidaceae (Pierik và ctv, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành,
do đó phương pháp cấy khơng cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn

phương pháp cấy có cực.
3.2.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ: Là nhân tố quan trọng ảnh hưởng rõ rệt tới sự phân chia tế bào và q
trình trao đổi chất trong các mơ ni cấy, đồng thời nó ảnh hưởng đến hoạt động của
auxin do đó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây nuôi cấy mô. Nhiệt độ
nuôi cấy cần được giữ ổn định trong khoảng 25 – 27oC.
Ánh sáng: Có ảnh hưởng mạnh đến q trình phát sinh hình thái của mơ ni
cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng. Cường độ ánh sáng
từ 1000 – 2500 lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy nhiều loại mô. Với cường độ
ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ
(Lê Xuân Đắc và ctv, 2004)
3.2.2.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng
sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các q
trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh trưởng

6


là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật. Nó đóng vai trị chủ đạo
trong q trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hố sinh khác cũng
như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường (Bùi
Trang Việt, 2002).
Chất điều hịa sinh trưởng auxin
Auxin có một số vai trò khác nhau trong sự sinh trưởng và phát triển của thực
vật. Auxin kích thích tế bào kéo dài và tăng trưởng, kích thích sự phân chia tế bào một
cách đặc biệt trong quá trình hình thành callus và sự hình thành rễ bất định. Ở nồng độ
cao ức chế sự phát triển của chồi nách thông qua cơ chế ưu thế ngọn và sự hình thành
phơi soma trong mơi trường ni cấy callus. Auxin hoạt hố sự phân bào, sinh trưởng
kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả khơng hạt, kích

thích sinh trưởng của ống phấn (Bùi Trang Việt, 2002). Ở nồng độ thấp và thường
dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát mơ phân sinh ngọn, vượt quá nồng độ
giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên.
Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu. Sự kéo dài của tế bào rễ cần
những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi. Hiệu ứng auxin giảm khi
nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao. Trong sự
hình thành rễ, đặc biệt là rễ bất định phát sinh từ các cơ quan dinh dưỡng thì hiệu quả
của auxin rất đặc trưng. Nếu trong mơi trường chỉ cho chất điều hịa sinh trưởng là
auxin thì mơ ni cấy chỉ xuất hiện rễ mà thơi. Cịn nếu muốn tạo chồi để có cây hồn
chỉnh thì phải bổ sung vào môi trường chất tạo chồi là cytokinin (Bùi Trang Việt,
2002).
Chất điều hịa sinh trưởng cytokinin
Nhóm này bao gồm dạng tự nhiên 2iP [γ-dimethylallylaminopurine), zeatin và
dạng tổng hợp là BAP (N6-benzylaminopurine) và Kinetin (6-furfurylaminopurine).
Dạng tổng hợp có hoạt tính sinh học rất cao nên được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy
mô. Cytokinin làm cho mô phồng lên, cảm ứng sự phát triển của chồi nách và chồi bất
định, điều khiển sự phân chia tế bào. Cytokinin bền nhiệt và có thể bổ sung vào mơi
trường trước khi hấp vô trùng. Trong nhân giống thường sử dụng BA nhiều hơn so với
các chất khác trong nhóm cytokinin vì hoạt tính của nó cao, bền với nhiệt, ánh sáng và
giá thành thấp hơn các chất khác.
7


Sự sinh trưởng tổng hợp cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác
nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ). Nó
hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ. Tuy nhiên, rễ là nơi
tổng hợp nhiều nhất. Vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụ phát triển yếu do khơng
tạo đủ cytokinin. Nó hoạt hố sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện trong sự
phối hợp với auxin. Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép
chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mơ, kích thích sự

phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hoá (Bùi Trang Việt,
2002).
4. Các yêu cầu của mơ hình
 Nguồn nước:
-

Nước giếng khoan để rửa dụng cụ

-

Nước lọc RO để pha môi trường sản xuất

-

Nước cất 1 lần để pha hóa chất.
 Năng lượng: điện năng
 Lao động: lao động kỹ thuật, lao động phổ thông.
 Diện tích:

-

Phịng cấy vơ trùng: 20 m2

-

Phịng Ni cây: 50 – 100 m2

-

Phịng pha mơi trường: 20 m2

-

Phịng hấp mơi trường, rửa dụng cụ: 20 m2

-

Khu vực huấn luyện cây: 50 m2
 Thiết bị:

-

Tủ cấy vô trùng

-

Nồi hấp tiệt trùng

-

Cân phân tích 4 số lẻ

-

Cân kỹ thuật 2 số lẻ
8


-

Máy đo pH

-

Tủ lạnh

-

Máy lọc nước RO

-

Máy cất nước 1 lần
 Dụng cụ: chai nước biển 500 ml, bình tam giác, …
 Hóa chất ni cấy mơ.

5. Tổng quan về mơ hình trên thế giới, ở Việt Nam và tại TPHCM
Phong lan nói chung và Hồ điệp nói riêng là một loài hoa rất được ưa chuộng ở
nước ta, ngoài ra đây là một loài hoa quý phái, màu sắc đa dạng, hình dáng đặc biệt.
Hơn thế nữa, nghiên cứu trên Hồ điệp (Phalaenopsis) cho thấy đây là loài hoa lâu tàn
vì chúng khơng thụ phấn được trong thiên nhiên (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002). Chính
vì điều này mà nhu cầu trang trí bằng hoa lan Hồ điệp đang được thịnh hành, nhưng
tình hình sản xuất trong nước khơng đủ đáp ứng nhu cầu thị trường, hàng năm chúng
ta phải nhập số lượng lớn hoa cắt cành và hoa để chậu, đặc biệt là các giống từ Thái
Lan và Đài Loan. Khó khăn trong nhân giống vơ tính Hồ điệp (Phalaenopsis) và Hồ
điệp lai (Doritaenopsis) là nguồn mẫu hạn chế do chúng là cây đơn thân. Việc sử dụng
chồi sinh dưỡng để ni cấy như các lồi lan khác sẽ làm tổn thương cây mẹ. Phương
pháp nhân giống lan Hồ điệp từ mầm ngủ phát hoa được áp dụng phổ biến, phương
pháp này không làm tổn thương cây mẹ mà vẫn tạo ra được nguồn cây con sạch bệnh
và đồng nhất về mặt di truyền. Phát hoa dùng làm nguồn mẫu khi hoa bắt đầu nở, cấy

mẫu trên môi trường Vacin-Went có bổ sung 20 g/l sucrose, kết hợp với cytokynin và
auxin (Dương Tấn Nhựt, 2006).
Nhân giống trực tiếp lan Hồ điệp từ mầm ngủ phát hoa không qua mô sẹo cho
kết quả khác nhau ở các vị trí chồi mầm khác nhau và mơi trường có nồng độ khống
thấp có hiệu quả chồi cao nhất, tuy nhiên sau thời gian ni cấy thì hệ số nhân chồi
chưa thật sự cao, số chồi được tạo thành từ 72 chồi ngủ là 92 chồi, như vậy trung bình
số chồi được sinh ra là 1,32 chồi/ mầm ngủ, trong đó ở mơi trường có bổ sung chất
điều hịa tăng trưởng thực vật với hàm lượng thấp nhất lại cho số chồi/ mầm là cao
nhất (2,8 chồi/mầm ngủ) (Nguyễn Thị Pha, 2011). Ở nghiên cứu khác người ta dùng
chồi ngủ sau khi chồi này đã được nuôi cấy hơn 60 ngày, các lá non đủ rộng để có thể
9


làm vật liệu tạo PLBs. Các mẫu lá thu được từ các chồi sinh dưỡng cắt theo kích thước
5 x 5 mm và đặt lên mơi trường MS ½ có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật NAA 1 mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l. Sau 10 tuần ni cấy thì PLBs bắt đầu
xuất hiện chủ yếu ở phần gốc lá, các phần khác của lá thì ít hơn (Nguyễn Văn Hiếu,
2008).
Không chỉ thị trường trong nước mà lan Hồ điệp cịn có giá trị kinh tế cao trên
thị trường thế giới, do đó nhiều nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồ điệp đã được
thực hiện từ lâu. Đốt phát hoa có mang mầm ngủ của lan Hồ điệp được nuôi cấy trên
môi trường Vacin-Went, kết quả chồi được hình thành sau 30 ngày, chồi tăng trưởng
tốt sau 60 ngày nuôi cấy. Ghi nhận kết quả ni cấy, đoạn phát hoa có mang mầm ngủ
cho thấy mầm ngủ càng xa gốc phát hoa sẽ phát triển tạo thành phát hoa thứ cấp, mầm
gần gốc phát hoa thì tạo thành cây con, phương pháp này ít tổn thương cây mẹ nhưng
sự hình thành mơ sẹo thì khó, chỉ có giá trị nhân giống tạo chồi nên hệ số nhân không
cao (Arditti, 1993).
Gần đây việc nhân nhanh PLBs của Hồ điệp bằng hệ thống Bioreactor đã được
áp dụng, trong đó PLBs hình thành trên lá in vitro ni bằng Bioreator sau 8 tuần nuôi
cấy thu được 18,000 PLBs từ 1,000 PLBs ban đầu. Nhiều môi trường đã được sử dụng

như Murashige-Skoog, Vacin-Went, Knudson C, Lindemann và Hyponex, cuối cùng
môi trường cho tỷ lệ PLBs cao nhất là Hyponex (Park, 2002). Phương pháp nuôi cấy
in vitro cuống lá của chồi ngủ phát hoa Hồ điệp trên môi trường Murashige and Skoog
(MS) có bổ sung 30 g/l sucrose 20 mg/l BA và 1 mg/l NAA sau 12 tuần đã tái tạo được
PLBs (So-Young, 2002), tuy nhiên phải nuôi cấy chồi ngủ đến khi xuất hiện lá để sử
dụng làm vật liệu cảm ứng tạo PLBs do đó thời gian thu nhận được PLBs cũng tương
đối dài.
Phương pháp tạo PLBs bằng cách cắt lát mỏng lóng phát hoa, sau 30 ngày ni
cấy đã có sự tạo thành PLBs ở bề mặt biểu bì và mặt cắt trên mơi trường Vaccin Went
có bổ sung 1 mg/l hoặc 5 mg/l BA đặc biệt là vùng gần đỉnh của phát hoa cho kết quả
tạo PLBs cao nhất. Sau đó, trong một nghiên cứu kế tiếp Lin đã bổ sung thêm vào môi
trường 100 mg/l myo-inositol thì phân tích hình thái giải phẫu của mẫu cấy cũng thấy
sự phân chia tế bào diễn ra sau 7 - 11 ngày nuôi cấy, và xuất hiện PLBs sau giai đoạn
phân chia khoảng 20 - 45 ngày. Phát hoa được sử dụng để vô mẫu ở giai đoạn còn non,
dài từ 4 – 10 cm, hàm lượng đường được sử dụng là 20 g/l (Chin-chi, 1987). Nghiên
10


cứu khác với nồng độ khử trùng mẫu là 1 % chlorine cộng với vài giọt Tween-20 và
lắc đều trong 15 phút. Chồi ngủ của phát hoa được nuôi cấy đến khi có từ 1 - 2 lá được
sử dụng làm vật liệu tạo PLBs, chồi được tách đỉnh sinh trưởng và cấy trên môi trường
New Dogashima (NDM) bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l BAP thì sau một năm thu
được kết quả với khoảng 10.000 PLBs từ một chồi mới (Ken, 1993). Ở Nhật Bản
người ta đã nhân giống vơ tính thành cơng lan Hồ điệp từ rất sớm. Phát hoa có chiều
dài 20 – 50 cm, cắt phần đỉnh khoảng 15 cm và khử trùng với 0,1 %
chlorobenzalconium trong 30 phút, cồn 70o khoảng vài phút, 1 % chlorinevới 0,05 %
Tween 80 trong 10 phút, sau 3 tháng thu được tỷ lệ 50 - 80% PLBs/ mẫu cấy
(Yoshiyuki, 1985).
Bên cạnh đó, người ta tạo PLBs Hồ điệp thông qua mô sẹo với thời gian từ mô
sẹo đến PLBs khoảng hơn 40 ngày nuôi cấy, tuy nhiên điều đặc biệt ở đây là lượng

chất điều hòa tăng trưởng thực vật dùng trong các nghiệm thức rất thấp. Sự kết hợp
giữa cytokynin và auxin nằm trong ngưỡng từ 0,01 – 1 mg/l, môi trường được sử dụng
là NDM . Phương pháp này có lợi về việc sử dụng chất điều hịa tăng trưởng thực vật
trong ni cấy, nhưng phải thông qua việc nuôi cấy chồi ngủ để dùng lá làm vật liệu
thí nghiệm nên thời gian nhân giống cũng chưa thật sự tối ưu. Theo hướng khác, nhân
giống Hồ điệp thông qua gây vết thương trên các chồi non tạo thành từ mầm ngủ phát
hoa, các mầm ngủ này được ni trên mơi trường Knudson C hay Murashige-Skoog
có hoặc khơng bổ sung chất điều hịa tăng trưởng thực vật. Tác động lên chồi non bằng
cách cắt chéo hay song song với trục thân hoặc hủy đỉnh sinh trưởng của chồi non
bằng dao cấy. Kết quả là thu nhận được mơ sẹo. Có thể dùng mơi trường MurashigeSkoog có bổ sung auxin và cytokynin để tạo ra số lượng lớn PLBs từ chồi non có 2 lá
non phát triển từ mầm ngủ, PLBs phát triển từ phần gốc lá là chủ yếu (Yoseph, 2008).
6. Nguồn gốc, xuất xứ của mô hình: mơ hình là kết hợp thành quả nghiên cứu
của các đề tài nghiên cứu cấp cơ sở và thực tế sản xuất cây giống lan Hồ điệp bằng
phương pháp nuôi cấy mô tại Trung tâm Nghiên cứu và phát triển Nơng nghiệp cơng
nghệ cao Tp HCM. Mơ hình này đã và đang được ứng dụng hiệu quả, đã chuyển giao
cây giống lan Hồ điệp cấy mô cho các nhà vườn ở Thành phố Hồ Chí Minh.
II. Quy trình kỹ thuật
1. Chuẩn bị, xây dựng mơ hình
11


(nêu rõ các bước chuẩn bị: bố trí sản xuất, giống, nguyên vật liệu, máy móc, thiết
bị, ... cần thiết để xây dựng mơ hình)
- Nguồn giống: Chọn các cây mẹ không bị sâu bệnh, sinh trưởng và phát triển khỏe,
hoa đẹp, siêng hoa, phát hoa dài. Phát hoa Hồ điệp được chọn khi nụ hoa đầu tiên nở,
cắt lấy phần phát hoa có chứa chồi ngủ, cắt khúc đốt khoảng 5 - 6 cm có chứa chồi
ngủ. Vị trí mầm ngủ của phát hoa Hồ điệp được đánh số thứ tự từ vị trí hoa nở đầu tiên
đến gốc phát hoa.
- Nguyên vật liệu: Môi trường nuôi cấy MS với các thành phần cơ bản như sau:
Stt

1

2

3

4

5

Thành phần
Đa lượng
NH4NO3
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
KNO3
KH2PO4
Vi lượng
MnSO4.4H2O
H3BO3
ZnSO4.4H2O
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Fe-EDTA
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
VITAMIN
Glycine

Pirydoxine
Myo-inositol
Nicotinic acid
Thiamin HCl
Thành phần khác
Đường
Nước dừa
Agar Hạ Long

Nồng độ (mg/l)

Ghi chú
Pha Stock

1650
440
370
1900
170
Pha Stock
22,3
6,2
8,6
0,83
0,25
0,025
0,025
Pha Stock
37,3
27,8

Pha Stock
2
0,5
100
0,5
0,1
20
100 ml/lít
5,8 -6

12

Cân
Cân


Máy móc, thiết bị: Tủ cấy vơ trùng, nồi hấp tiệt trùng, cân phân tích, cân kỹ
thuật, máy đo pH, máy cất nước, phịng ni cây.
2.

Quy trình hoạt động của mơ hình (kỹ thuật ni trồng, chăm sóc, phịng trừ
dịch hại; vận hành mơ hình…)

Qui trình nhân giống cây lan Hồ điệp bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Phát hoa (bắt đầu nở hoa đầu tiên)

Lau sạch, cắt đốt chứa các chồi ngủ
Khử trùng

13-15 tháng

Môi trường nuôi cấy tạo PLBs, chồi:
MS + 3 mg/l BA.
2 -3 tháng
PLBs, Chồi hình thành từ
chồi ngủ
Tạo PLBs
Tạo PLBs từ lá non : MS + 1 mg/l NAA + 10 mg/l
adenin + 10 mg/l BA + 25 mg/l đường
3 tháng
PLBs, chồi

Nhân chồi, PLBs: MS + 1 mg/l BA
2 - 3 tháng
Môi trường tăng trưởng cây: 3 g/l Hyponex 7-6-19 + 5 % nước dừa + 30
g/l chuối + 30 g/l sắn + 20 g/l đường
2 tháng
Cây nhỏ
1 tháng
Cây lớn: cao 4-5 cm, 3-4 rễ dài 2 cm, 3-4 lá

13


Qui trình nhân giống cây lan Hồ điệp bằng phương pháp nuôi cấy mô
Giai đoạn vô mẫu (2 - 3 tháng): Phát hoa Hồ điệp được cắt khúc với chiều dài 5
–6

cm bao gồm chồi ngủ. Cho mẫu phát hoa vừa cắt vào erlen và lắc đều với xà phòng

đã được pha lỗng trong 30 phút, rửa sạch xà phịng bằng nước. Đưa mẫu vào tủ cấy
vô trùng, chuyển mẫu vào erlen có chứa cồn 70 o, lắc đều mẫu trong 1 phút, rửa lại 3
lần bằng nước cất vô trùng. Khử trùng mẫu theo tỷ lệ Javel: nước = 1:1. Bổ sung 2 giọt
Tween 20 nhằm nâng cao hiệu quả khử trùng, lắc đều mẫu. Sau đó rửa mẫu bằng nước
cất vô trùng 5 - 6 lần, cắt bỏ hai đầu của khúc cắt mẫu khoảng 0,5 cm (loại bỏ phần
mẫu bị tổn thương). Cấy mẫu vào môi trường MS có bổ sung 20 g/l sucrose và 8 g/l
agar.
Giai đoạn xử lý hóa nâu đốt phát hoa Hồ điệp bằng acid ascorbic (2 tháng): Để
ngăn chặn q trình hóa nâu mẫu khi nuôi cấy đốt phát hoa hồ điệp chúng tôi tiến hành
sử dụng acid ascorbic như một chất chống oxi hóa các hợp chất phenol do cây tiết ra
khi bị tổn thương, đối với việc nuôi cấy đốt phát hoa của Lan hồ điệp thì mơi trường
thích hợp hạn chế sự hóa nâu và tỉ lệ mẫu chết thấp do hóa nâu là mơi trường MS bổ
sung acid ascorbic 75 mg/l.

Hình 1: Mẫu phát hoa Hồ điệp dùng làm vật liệu nuôi cấy

Giai đoạn tạo PLBs trực tiếp từ đốt phát hoa Hồ điệp (2-3 tháng): Đốt phát hoa
sau khi xử lý hóa nâu, chọn vị trí đốt phát hoa Hồ điệp thứ 3 được đánh số thứ tự từ vị
trí hoa nở đầu tiên đến gốc phát hoa, các đốt phát hoa này được cắt ngang mầm ngủ

14


bằng cách cắt ngang chồi non, sau đó được ni cấy trên môi trường MS bổ sung BA 3
mg/l ở điều kiện phịng ni cây có nhiệt độ 27 ± 2 oC, ánh sáng khuyếch tán từ các kệ
nuôi lân cận (6,75 µmol/m2/s), ẩm độ là 60 ± 5%. Sau 2 -3 tháng nuôi cấy, các PLBs
được tạo thành phục vụ làm nguồn vật liệu cho mục đích nhân nhanh, tái sinh chồi.

Hình 2: Tạo PLBs từ chồi ngủ phát hoa Hồ điệp

Giai đoạn nhân nhanh PLBs, tái sinh chồi từ PLBs (2-3 tháng): PLBs được nuôi
cấy trên môi trường MS bổ sung BA 1 mg/l để tái sinh chồi. Điều kiện ni cấy phịng
ni cây có nhiệt độ là 27 ± 2oC, cường độ ánh sáng 27 µmol/m2/s, ẩm độ là 60 ± 5%.
Sau 3 tháng nuôi cấy, chồi thu được dùng làm vật liệu cho quá trình tạo rễ.
a
b

Hình 3: PLBs (a) và chồi lan Hồ điệp

(b)

Giai đoạn tăng trưởng cây (3-5 tháng): Chồi cao khoảng 2 – 2,5 cm nuôi cấy
trên môi trường 3 g/l Hyponex 7-6-19 bổ sung 5% nước dừa, 30 g/l chuối; 30 g/l khoai
tây, 20 g/l đường 8 g/l agar và 0,5 g/l than hoạt tính. Điều kiện ni cấy phịng ni
15


cây có nhiệt độ là 27 ± 2oC, cường độ ánh sáng 27 µmol/m2/s, ẩm độ là 60 ± 5%. Sau 3
tháng nuôi cấy thu được cây lan Hồ điệp in vitro hồn chỉnh.

Hình 4: Cây Hồ điệp cấy mơ hoàn chỉnh

3. Khai thác, tiêu thụ sản phẩm
Tiêu chuẩn cây Hồ điệp cấy mơ: Cây Hồ điệp cấy mơ hồn chỉnh có chiều cao
trung bình từ 4-5 cm, có 3-4 rễ, 3-4 lá là các cây đạt tiêu chuẩn để trồng ra vườn ươm,
phục vụ cho công tác sản xuất cây giống lan Hồ điệp cấy mô.
Hệ thống tiêu thụ, phân phối: Cây Hồ điệp cấy mô đủ tiêu chuẩn được cung cấp
cho các nhà vườn, trang trại trồng lan Hồ điệp, bước đầu chủ động nguồn giống trong
nước, hạn chế nhập nội.
III. Đánh giá chất lượng sản phẩm, chất lượng cơng nghệ của mơ hình

- Áp dụng mơ hình nhân giống lan Hồ điệp bằng phương pháp nuôi cấy mô tạo ra
số lượng lớn cây giống, đồng nhất, sạch bệnh, đáp ứng được nhu cầu cây giống của thị
trường, có khả năng cạnh tranh cao.
- So với phương pháp nhân giống lan Hồ điệp truyền thống: ươm keki, công nghệ
nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo ra số lượng lớn cây giống, hệ số nhân cao, chất lượng
đồng nhất, sạch bệnh so với phương pháp nhân giống truyền thống có hệ số nhân
giống thấp, cây giống khơng đồng đều, không đủ cây giống trồng ở quy mô lớn.
IV. Những thuận lợi, khó khăn và lưu ý khi triển khai mơ hình
V. Hiệu quả đầu tư mơ hình (ước tính)
1. Hiệu quả về kinh tế (vốn đầu tư, chi phí, sản lượng, doanh thu, tỉ suất lợi
nhuận, …)
Giảm chi phí giá thành cây giống Hồ điệp, nâng cao chất lượng và năng suất
16


cây trồng. Góp phần phát triển kinh tế xã hội nơng thơn.
Ứng dụng vào quy trình sản xuất lan Hồ Điệp bằng phương pháp nuôi cấy mô nhằm
nâng cao hiệu quả nhân giống, tạo được nguồn giống ổn định chất lượng tốt, đáp ứng nhu
cầu tiêu thụ trong và ngoài nước.
2. Hiệu quả về xã hội (tạo bao nhiêu việc làm, …)
- Quy trình nhân giống lan Hồ điệp bằng phương pháp ni cấy mơ tế bào thực
vật góp phần tạo thêm công ăn việc làm cho các nhà sản xuất và ni trồng lan. Hồn
thiện và phát triển các biện pháp nhân giống để duy trì giống gốc và nhân nhanh về
mặt số lượng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen. Việc phát triển các mơ hình
trồng lan Hồ điệp cịn góp phần làm đẹp cảnh quan mơi trường góp phần thúc đẩy
ngành du lịch sinh thái phát triển.
- Tạo dựng được mơ hình liên kết khoa học – đào tạo – sản xuất, phục vụ trực
tiếp các chương trình kinh tế xã hội.
- Đáp ứng được nhu cầu về giống lan Hồ điệp cho người trồng lan trên địa bàn
thành phố Hồ Chí Minh, Lâm Đồng và các tỉnh lân cận.

- Chủ động được nguồn giống phục vụ cho sản xuất hoa lan trong nước, giảm
thiểu nhập khẩu cây giống từ nước ngoài.
- Thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội, chương trình chuyển đổi cơ cấu kinh tế
nông nghiệp, phát triển nông nghiệp đô thị của thành phố và cả nước.
3. Hiệu quả về môi trường
Hoàn thiện hơn kỹ thuật nhân giống lan Hồ Điệp, tạo số lượng lớn cây giống
cung cấp cho thị trường, góp phần chống việc khai thác cây giống quá mức ngồi tự
nhiên.
4. Khả năng nhân rộng: mơ hình có khả năng nhân rộng tại các phịng thí nghiệm
ni cấy mơ tế bào thực vật trên quy mô cả nước.
VI. Địa chỉ chuyển giao, tư vấn
1. Địa chỉ tham quan mô hình
Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Nông
nghiệp Công nghệ cao tp. HCM
Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp. Hồ Chí Minh
2. Địa chỉ cung cấp nguyên vật liệu, máy móc, thiết bị
3. Địa chỉ chuyển giao, tư vấn: Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Trung tâm
Nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao tp. HCM
17


Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp. Hồ Chí Minh
Đã áp dụng mơ hình để cung cấp 15.000 cây Hồ điệp cấy mơ cho ơng Ơng Phan Hồng
Hải
Địa chỉ: 435/11 Bình Quới, phường 28, quận Bình Thạnh, Tp HCM
Điện thoại: 0908 247 959
KẾT LUẬN
Qua quá trình thực hiện mơ hình quy trình nhân giống lan Hồ điệp bằng phương
pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chúng tơi đã có một số kết luận sau:
Phát hoa Hồ điệp được cắt khúc 5-6 cm có mầm ngủ khử trùng theo tỷ lệ Javel:

nước = 1:1, cấy mẫu vào mơi trường MS có bổ sung 20 g/l sucrose và 8 g/l agar.
Mơi trường thích hợp để xử lý hóa nâu nuôi cấy đốt phát hoa Hồ điệp là môi
trường MS có bổ sung acid ascorbic 75 mg/l.
Vị trí đốt phát hoa Hồ điệp thích hợp để tạo PLBs là đốt phát hoa thứ 3, phương
pháp cắt ngang mầm ngủ đốt phát hoa Hồ điệp và mơi trường thích hợp để tạo PLBs từ
phát hoa Hồ điệp là môi trường MS có bổ sung BA 3 mg/l.
Mơi trường thích hợp cho sự tái sinh chồi từ PLBs lan Hồ điệp là mơi trường
MS có bổ sung BA 1 mg/l.
Mơi trường 3 g/l Hyponex 7-6-19 bổ sung 5% nước dừa, 30 g/l chuối; 30 g/l
khoai tây, 20 g/l đường 8 g/l agar và 0,5 g/l than hoạt tính

18


TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1].

Phạm Hồng Hộ. (1975). Hiển hoa bí tử. Trung tâm sản xuất học liệu. Bộ văn

hóa Giáo dục và Thanh niên.
[2]. Võ Thị Bạch Mai. (1996). Nhân giống vơ tính một số lan Hồ điệp
(Phalaenopsis sp.). Luận án phó tiến sĩ khoa học Sinh học TP.HCM. P:6-87.
[3]. Mai Trần Ngọc Tiếng. (2002). Những hiện tượng kỳ thú trong đời sống cây
cảnh. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP.HCM.
[4]. Dương Tấn Nhựt. (2006). Ứng dụng Công nghệ Nuôi cấy mô tế bào thực vật
trong việc nhân nhanh lan Hài và lan Hồ điệp. Phân viện Sinh học Đà Lạt.
[5]. Nguyễn Thị Pha và ctv. (2011). Nuôi cấy mầm ngủ phát hoa lan Hồ điệp
(Phalaenopsis sp.). Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ.
[6]. Nguyễn Văn Hiếu. (2008). Nhân giống invitro lan Hồ điệp. Trung tâm Công
nghệ Sinh học TP.HCM.

[7]. Bùi Trang Việt. (2000). Sinh lý Thực vật Đại cương. Phần II. Nhà xuất bản Đại
học Quốc gia TP.HCM.
[8]. Bùi Trang Việt. (2002). Sinh lý Thực vật Đại cương. Phần I. Nhà xuất bản Đại
học Quốc gia TP.HCM.
[9]. Arditti, J., Ernst, R. (1993). Micropropagation of orchids. Wiley Publishers.
New York
[10]. Park, S.Y., Murthy, H.N. và Paek, K.Y. (2002). Rapid propagation of
Phalaenopsis from floral stalk-derived leaves. In Vitro Cell Dev Biol Plant 38:168–
172.
[11]. So-young, P., Hosakatte, N. M. và Kee-yoeup, P. (2002). Rapid propagation of
phalaenopsis from floral stalk-derived leaves. In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant
38:168–172.
[12]. Chin-chi, L. (1987). Histological observations on in vitro formation of
protocorm-like bodies from flower atalk internodes of Phalaenopsis. Lindleyana 2(1):
58 - 65.
[13]. Ken, and Masahiro, M. (1993). Micropropagation of Phalaenopsis and
Doritaenopsis by culturing shoot tips of flower stalk buds. Plant Cell Reports 13: 711.
[14]. Yoshiyuki, H. và Tadashi, A. (1985). New means of Phalaenopsis propagation
with internodal section of flower stalk. J. Japan. Soc. Hort. Sci. 54(3) : 379-387.
[15]. Joseph, A. (2008). Micropropagation of orchids. Blackwell Publishing Ltd, Vol.
2, p. 906-1029.

19