Phân tích đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty thể ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

Hồng Thị Thùy Dung

PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦ A DNA TY THỂ
Ở BỆNH NHÂN UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội Năm 2012


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẤT
Viết tắt

Viết đầy đủ

mtDNA

Mitochondrial DNA (AND ty thể)

MT ND

MitochondrialNADH dehydrogenase

MTCYTb MitochondrialCytochrome b
MTCO

MitochondrialCytochrome c oxidase

MTATP

MitochondrialATP synthase

CPEO

Chronic progressive external ophthalmoplegia

KSS

Kearn–Sayre syndrome

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng biến tình hiệu năng cao)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

MRI

Magnetic resonance imaging (Chụp cộng hƣởng từ)

PBS

Phosphate buffered saline (Dung dịch đệm phosphate)

PCR

Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PET

Positron emission tomography (Chụp cắt lớp phát xạ positron)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hính độ dài đoạn cắt
giới hạn)

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SNP

Single nucleotide polymorphism (Đa hính nucleotide đơn)

SSCP

Single strand conformation polymorphism (Đa hính cấu hính sợi đơn)

TBE

Tris borate EDTA

TNM

Tumor Node  Metastasis


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

13 gen mã hóa cho các protein tham gia chuỗi hô hấp tế bào [7].

Bảng 2

Các gen mã hóa cho 22 tRNA của genome ty thể [7]

Bảng 3

Hệ thống phân loại TNM đối với ung thƣ đại trực tràng

Bảng 4

Thống kê mẫu sử dụng

Bảng 5

Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 6

Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 7

Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR

Bảng 8

Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l

Bảng 91

Thành phần phản ứng ủ enzyme với thể tích 30 µl

Bảng 10

Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid Nucleic

Bảng 11

Sự phân tách DNA trong gel polyacrylamide khơng biến tính

Bảng 12

Thống kê mẫu tách chiết DNA của bênh
̣ nhân ung thƣ đa ̣i trƣ ̣c
tràng theo các đặc điểm bệnh học lâm sàng

Bảng 13

Tỷ lệ phần trăm đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh
nhân ung thƣ đại trực tràng theo vị trí mơ

Bảng 14

Thống kê tỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh
nhân ung thƣ đại trực tràng theo các đặc điểm lâm sàng.

Bảng 15

Thống kê mức độ heteroplasmy xảy ra trong mtDNA


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1

Cấu tạo bào quan ty thể

Hình 2

Sơ đồ cấu tạo mtDNA người

Hình 3

Các bệnh liên quan đến rối loạn ty thể

Hình 4

Một số bệnh ung thư liên quan đến đột biến ty thể

Hình 5

Hình ảnh đại trực tràng

Hình 6

Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Hình 7

Đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA

Hình 8

Minh họa sự bắt cặp của hai cặp mồi 49771 và 49772 trên
khuôn của mtDNA bị đột biến mất đoạn 4977 bp

Hình 9

Minh họa sự cắt của enzyme HaeIII đối với sản phẩm PCR của đột
biến mất đoạn 4977 bp

Hình 10

Hình ảnh điện di DNA t ổng tách chiết từ mơ bệnh nhân ung thư
đại trực tràng

Hình 11

Ảnh điện di kiểm tra các sản phẩm của phản ứng PCR của mtDNA
ở cả mẫu u và lân cận u

Hình 12

Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR có đối chứng âm của mtDNA

Hình 13

Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trường hợp có đột biến mất
đoạn 4977 bp trong mtDNA.

Hình 14

Ảnh kết quả xử lý sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 4977–2 với
enzyme giới hạn.

Hình 15

Phần mềm đọc kết quả giải trình tự bioedit so sánh trình tự của
các mẫu với nhau

Hình 16

Biểu đồ thể hiện tỷ lệ phần trăm đột biến mất đoạn 4977 bp trong
mtDNA của bệnh nhân ung thư đại trực tràng theo vị trí mơ

Hình 17

Biểu đồ thể hiện tỷ lệ heteroplasmy xảy ra trong mtDNA


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .........................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .........................................................................3
1.1. DNA TY THỂ ........................................................................................3
1.1.1. Cấu trúc genome ty thể ...................................................................4
1.1.2. Cơ chế di truyền của hệ gen ty thể. .................................................7
1.1.3. Các rối loạn ty thể [4,53]. ...............................................................8
1.2. ĐỘT BIẾN DNA TY THỂ (MT DNA)  CHỈ THỊ SINH HỌC
TIỀM NĂNG TRONG UNG THƢ. ..............................................................9
1.2.1. Các đột biến trên mtDNA ...............................................................9
1.2.2. Mối liên hệ của đột biến mtDNA với bệnh ung thƣ .....................11
1.2.3. Mối liên quan đột biến mất đoạn của mtDNA với bệnh ung thƣ chỉ thị sinh học tiềm năng trong ung thƣ ...................................................14
1.3. UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG VÀ MỐI LIÊN HỆ VỚI ĐỘT
BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 BP XẢY RA TRONG DNA TY THỂ ..............17
1.3.1. Ung thƣ đại trực tràng ...................................................................17
1.3.2. Mối liên hệ giữa đột biến mất đoạn 4977 bp xảy ra trong mtDNA
và ung thƣ đại trực tràng ............................................................................23
1.3.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu biến đổi của gen trong ung thƣ .....24
1.3.4. Tính hính nghiên cứu đột biến mtDNA ở Việt Nam ....................29
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..............................30
2.1. NGUYÊN LIỆU...................................................................................30
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................30
2.1.2. Hóa chất ........................................................................................31
2.1.3. Thiết bị ..........................................................................................31
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................32
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ mô .....................................................32

2.2.2. Khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp mtDNA bằng PCR ............33


2.2.3. Xử lý sản phẩm PCR khuếch đại đột biến mất đoạn 4977 bp
mtDNA bằng enzyme HaeIII .....................................................................37
2.2.4. Quy trính tinh sạch sản phẩm PCR sƣ̉ du ̣ng kit QIAQUICK gel
extraction ....................................................................................................38
2.2.5. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel .......................................39
2.2.6. Phƣơng pháp giải trính tự..............................................................40
2.2.7. Tình tốn thống kê ........................................................................41
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................42
3.1. ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC LÂM SÀNG CỦA CÁC BỆNH NHÂN
UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRONG NGHIÊN CỨU .....................42
3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ UNG
THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ..........................................................................43
3.3. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦ A
DNA TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR ...................................................44
3.4. KẾT QUẢ XỬ LÝ SẢN PHẨM PCR SỬ DỤNG CẶP MỒI 4977–2
BẰNG ENZYME GIỚI HẠN .....................................................................47
3.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ SẢN PHẨM PCR CỦA ĐỘT BIẾN
MẤT ĐOẠN 4977 bp CỦA mtDNA ...........................................................49
3.6. PHÂN TÍCH MỚI LIÊN QUAN GIƢ̃ A ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN
4977 bp CỦ A DNA TY THỂ VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC LÂM
SÀNG CỦA BÊNH UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG ...............................51
3.6.1. Khảo sát đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân
ung thƣ đại trực tràng theo vị trì mơ ..........................................................51
3.6.2. Khảo sát đột biến mất đoạn 4977 bp trong mtDNA của bệnh nhân
ung thƣ đại trực tràng theo các đặc điểm lâm sàng khác ...........................52
3.7. THỐNG KÊ MỨC ĐỘ HETEROPLASMY XẢY RA TRONG DNA
TY THỂ .........................................................................................................54

KẾT LUẬN ...................................................................................................58


KIẾN NGHỊ ..................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................60
PHỤ LỤC ........................................................................................................ I
Phụ lục 1. Danh sách bê ̣nh nhân ung thƣ đa ̣i trƣ̣c tràng với các đă ̣c điể m
bê ̣nh ho ̣c lâm sàng đƣơ ̣c sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u ..................................... i
Phụ lục 2. Các dạng đột biến mtDNA và các loại ung thƣ liên quan ..........x


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

MỞ ĐẦU
Ty thể (mitochondria) là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn có lớp
màng kép và hệ gene riêng. Ty thể đƣợc coi là trung tâm năng lượng của tế bào ví
là nơi chuyển hóa các chất hữu cơ thành năng lƣợng tế bào có thể sử dụng đƣợc
ATP. Ngồi ra, ty thể cịn đóng vai trị quan trọng trong nhiều q trính chuyển hóa
khác nhƣ: Apoptosis, tổn thƣơng tế bào thần kinh do thoát các chất trung gian
glutamate, tăng sinh tế bào, điều hịa trạng thái oxi hóa khử của tế bào, tổng hợp
nhân heme, tổng hợp steroid, tạo nhiệt giúp giữ ấm cho có thể [12,36]. Hệ gen ty
thể có chứa hàng trăm đến hàng nghín bản sao DNA ty thể (mtDNA), chúng có cấu
trúc mạch vịng, kìch thƣớc khoảng 15000 – 17000 bp, chứa 37 gen mã hóa cho các
protein trong chuỗi hô hấp, các tRNA và rRNA. Tuy nhiên, ty thể dễ bị tổn thƣơng,
có tỷ lệ đột biến cao hơn so với DNA nhân ví những lý do sau: (1) Ty thể có chứa
một hệ gen độc lập với gen nhân, kìch thƣớc bé. (2) Do sự vắng mặt của các protein
histone, cơ chế bảo vệ và sửa chữa DNA ở mức độ đơn giản. (3) Hệ gen ty thể ở
gần vị trì phát sinh các gốc tự do (ROS – Reactive Oxygen species). Đây là nguyên

nhân chình gây nên các rối loạn của mtDNA và gây nên nhiều căn bệnh khác nhau
[18].
Các bệnh do rối loạn mtDNA rất đa dạng có thể phát sinh do những đột biến
ở gen nhân hoặc mtDNA, có thể liên quan đến rối loạn quá trính tổng hợp protein
hay đơn thuần chỉ là những đột biến làm thay đổi các nucleotide. Các rối loạn này
có thể chỉ ảnh hƣởng đến một hoặc nhiều cơ quan trên cơ thể với mức độ biểu hiện
khác nhau và có thể xảy ra ở bất cứ lứa tuổi nào [17].
Trong vài năm trở lại đây, những rối loạn ty thể liên quan đến đột biến
mtDNA đƣợc xem là một trong những mục tiêu nghiên cứu cơ bản của di truyền
học và y học. Đặc biệt, hƣớng nghiên cứu sử dụng mtDNA nhƣ một chỉ thị sinh học
cho các bệnh chuyển hóa hiếm gặp, lão hóa, xác định các đặc tình di truyền quần
thể sử dụng các dấu chuẩn di truyền của mẹ [1]. Cho đến nay, Trên 150 bệnh do rối
loạn mtDNA đã đƣợc thống kê nhƣ: Bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber, Bệnh
thần kinh- cơ, suy gan, viêm não, liệt mắt tăng tiến mạn tình, đái tháo đƣờng và câm

Đại học Khoa học Tự nhiên

1

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hồng Thị Thùy Dung

điếc…Cịn rất nhiều bệnh nghi ngờ là có liên quan đến rối loạn mtDNA đã và đang
đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu [17]. Đặc biệt là những nghiên cứu về đột biến
mtDNA và mối liên quan đến các bệnh ung thƣ [8,9]. Với nhiều cơng trính khoa
học đƣợc cơng bố trong khoảng hai thập niên qua đã chứng tỏ các đột biến mất đoạn

4977 bp là một loại đột biến thƣờng gặp trong hệ gen ty thể có vai trị nhất định đối
với ung thƣ [10].
Trên cơ sở sự khác nhau về số bản sao DNA ty thể trong tế bào ung thƣ và tế
bào bính thƣờng, có thể tiến hành định lƣợng đột biến mất đoạn mtDNA trong các
khối u và dịch cơ thể. Nhƣ vậy, đột biến mất đoạn xảy ra trong mtDNA có thể là
những chỉ thị sinh học tiềm năng, có tình ứng dụng cao trong chẩn đốn và điều trị
ung thƣ ở giai đoạn sớm [23,24].
Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:
“Phân tích đột biến mất đoạn 4977 bp của DNA ty th ể ở bệnh nhân ung
thƣ đại trực tràng”
với mục đìch:
 Xác định đƣơ ̣c t ỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp của mtDNA ở bệnh
nhân ung thƣ đại trực tràng.
 Đánh giá mối liên quan giƣ̃a t ỷ lệ đột biến mất đoạn 4977 bp của
mtDNA với các đặc điểm lâm sàng của bê ̣nh ung thƣ đ ại trực tràng ở
ngƣời Việt Nam.
Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc
Phịng thì nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Đại học Khoa học Tự nhiên

2

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. DNA TY THỂ
Ty thể là những bào quan có thể
đƣợc tím thấy trong gần nhƣ tất cả các
tế bào có nhân, bao gồm cả thực vật,
động vật, nấm và sinh vật nguyên sinh
(Hình 1) [36]. Số lƣợng của ty thể hiện
diện trong mỗi tế bào tùy thuộc vào
nhu cầu chuyển hóa của tế bào đó và
có thể thay đổi từ một ty thể lớn đến
hàng ngàn ty thể khác nhau trong một Hình 1. Cấu tạo bào quan ty thể [51]
tế bào.
Cấu trúc của ty thể: Ty thể đƣợc mô tả lần đầu tiên bởi Altmann vào năm
1890 và sau đó, cấu trúc siêu hiển vi của ty thể đã đƣợc nghiên cứu chi tiết bởi
Palade (1952) và Sjostrand (1953) [18]. Đây là bào quan có hính trịn hoặc hính trụ
dài, có kìch thƣớc đƣờng kình 0,2-1 µm, chiều dài 2-5 µm. Tồn bộ cấu trúc của ty
thể đƣợc bao bọc bởi hai lớp màng đều đƣợc cấu tạo bởi protein và lớp
phospholipid kép. Tuy nhiên, mỗi màng có những đặc trƣng riêng khác nhau. Lớp
màng ngoài bao trùm, tạo nên ranh giới ngoài của ty thể, lớp màng trong tạo thành
các nếp gấp (mào - cristae) hƣớng vào tâm và là nơi khu trú của các enzyme hô hấp.
Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang chứa chất nền
(matrix) nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng. Chất
nền này tƣơng đối đậm đặc và có thể tím thấy các sợi DNA, ribosome hoặc các hạt
nhỏ tại đây. Ty thể có thể mã hóa một phần các protein của chúng bằng chình bộ
máy di truyền của riêng mính [18].
Thành phần hóa học của ty thể: protein chiếm khoảng 60 – 70% trọng lƣợng
khô và tồn tại dƣới hai dạng khác nhau. Một phần tham gia vào thành phần siêu cấu
trúc của ty thể, phần khác hòa tan trong matrix, lipid chiếm khoảng 25–30% trọng
lƣợng khô, chủ yếu là các phospholipid và phần ìt cholesterol, ARN khoảng 0,5-

Đại học Khoa học Tự nhiên

3

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

3%, DNA khoảng 0,024 – 0,34%. Ngồi ra, ty thể cịn chứa một lƣợng lớn các hệ
enzyme tham gia vào q trính hơ hấp của tế bào nhƣ: các cytochrome oxydase,
succinate dehydrogenase, các enzyme của chuỗi chuyền điện tử NADP và NAD
cytochrome reductase [18].
Hoạt động của ty thể: Màng trong ty thể vận chuyển các cơ chất tìch điện âm
nhƣ ADP, ATP, phosphate, oxoglutarate, citrate, glutamate và malate. Các phản
ứng của chu trính citric acid, q trính ơxy hóa acid béo và một vài giai đoạn của
quá trính tổng hợp urea cũng nhƣ tân tạo đƣờng cũng xảy ra trong ty thể. Năng
lƣợng đƣợc sản xuất bởi q trính hơ hấp ty thể đƣợc sử dụng trong tổng hợp ATP
bởi một cơ chế rất phức tạp gọi là q trính phosphoryl hóa ơxy hóa (oxidative
phosphorylation). Ngồi q trính phosphoryl hóa ơxy hóa và các con đƣờng
chuyển hóa, ty thể cịn tham gia vào các quá trính khác nhƣ quá trính sinh nhiệt, tạo
gốc tự do, cân bằng calcium, tổng hợp protein và quá trính chết theo chu trính của tế
bào (apoptosis)[12,18].
Sự sinh sản của ty thể: Ví ty thể có hệ di truyền độc lập nên ty thể có khả
năng tự sinh sản bằng các phân đôi ty thể mẹ để sinh ra các ty thể con. thời gian để
đổi mới một nửa số lƣợng ty thể trong tế bào khoảng 10 ngày. Ví rằng mtDNA
giống với DNA vi khuẩn về kìch thƣớc và thành phần rARN cũng nhƣ có sự giống

nhau về cơ chế tổng hợp protein giữa ty thể và vi khuẩn nên các nhà tế bào học cho
rằng ty thể là kết quả của sự cộng sinh của dạng vi khuẩn hiếu khì trong tế bào trong
q trính tiến hố sơ khai của tế bào Eucaryota [3].
1.1.1. Cấu trúc genome ty thể
Trong hầu hết các sinh vật đa bào, mtDNA có cấu trúc sợi đơi, mạch vịng
(Hình 2). Hai sợi đơn của phân tử mtDNA đƣợc phân biệt dựa vào hàm lƣợng
Nucleotide, trong đó sợi giàu Guanine đƣợc gọi là sợi nặng và sợi giàu Cytosine là
sợi nhẹ. Tuy nhiên, ở nhiều sinh vật đơn bào nhƣ động vật nguyên sinh có tiêm mao
Tetrahymena hay tảo xanh Chlamydomonas reinhardtii và một vài trƣờng hợp hiếm
gặp ở sinh vật đa bào nhƣ một số lồi Ruột khoang, mtDNA có cấu trúc mạch thẳng
[51].

Đại học Khoa học Tự nhiên

4

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hồng Thị Thùy Dung

Hình 2: Sơ đồ cấu tạo mtDNA người [51,52]
Ở động vật đa bào nói chung, một ty thể chứa khoảng 10 bản sao của mtDNA, nên
trong mỗi tế bào có khoảng 100 – 10.000 bản sao mtDNA(tế bào trứng và tinh trùng
là 2 trƣờng hợp ngoại lệ), các bản sao này tồn tại độc lập và phân bố tự do trong ty
thể hoặc có khi bám vào màng trong ty thể và mỗi phân tử mtDNA sợi đơi có kìch
thƣớc khoảng 15.000 – 17.000 bp. Ở ngƣời, mtDNA có kìch thƣớc 16.569 cặp bazơ,
bao gồm 28 gen phân bố trên sợi nặng và 9 gen phân bố trên sợi nhẹ.

Bảng 1: 13 gen mã hóa cho các protein tham gia chuỗi hơ hấp tế bào[7]
Gen mã hóa

Protein

MTND1, MTND2, MTND3, MTND4, NADH

dehydrogenase

MTND4L, MTND5, MTND6

(Phức hệ I)

MTCYTb

Coenzyme

MTCOI, MTCOII, MTCOIII

Cytochrome c oxidase (Phức hệ IV)

MTATP6 , MTATP8

ATP synthase

Q



Cytochrome

c

reductase / Cytochrome b (Phức hệ III)

Trong số 37 gen này, có 13 gen mã hóa cho protein tham gia vào chuỗi hô
hấp tế bào (Bảng 1), 22 gen mã hóa cho tRNA (Bảng 2), 2 gen mã hóa cho rRNA là
MT-RNR1(mã hóa tiểu đơn vị nhỏ 12S) và MT-RNR2 (mã hóa tiểu đơn vị lớn 16s).
13 chuỗi polypeptide đƣợc mã hóa bởi DNA ty thể là thành phần của phức hệ hơ
hấp của ty thể, trong đó có 7 tiểu phần (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5, 6) trong số 46 chuỗi
polypepetide của phức hệ I (NADH dehydrogenase), 1 tiểu phần (cytochrome b -

Đại học Khoa học Tự nhiên

5

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

Cytb) trong số 11 chuỗi polypeptide của phức hệ III (Phức hệ bc1), 3 tiểu phần (CO
I, II, III) trong số 13 polypeptide của phức hệ IV (cytochrome c oxidase) và 2 tiểu
phần (ATPase 6 và 8) trong số 16 polypeptide của phức hệ V (ATP synthase) [7].
Bảng 2: Các gen mã hóa cho 22 tRNA của genome ty thể [7]

Amino Acid

3

ký 1

ký

mtDNA

tự

tự

Alanine

Ala

A

MTTA

Arginine

Arg

R

MTTR

Asparagine

Asn

N

MTTN

Aspartic

Asp

D

MTTD

Cysteine

Cys

C

MTTC

Glutamic

Glu

E

MTTE

Glutamine

Gln

Q

MTTQ

Glycine

Gly

G

MTTG

Histidine

His

H

MTTH

Isoleucine

Ile

I

MTTI

Leucine

Leu

L

MTTL1,
MTTL2

Lysine

Lys

K

MTTK

Methionine

Met

M

MTTM

Phenylalanine Phe

F

MTTF

Proline

Pro

P

MTTP

Serine

Ser

S

MTTS, MTTS2

Threonine

Thr

T

MTTT

Tryptophan

Trp

W

MTTW

Tyrosine

Tyr

Y

MTTY

Valine

Val

V

MTTV

Đại học Khoa học Tự nhiên

6

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

Các protein khác của ty thể bao gồm tất cả 4 tiểu đơn vị của phức hệ II (succinate
dehydrogenase), tiểu đơn vị DNA polymerase của ty thể, các thành phần của
RNA polymerase của ty thể, yếu tố phiên mã của ty thể (mtTFA), các protein
ribosome của ty thể, các yếu tố kéo dài chuỗi và các enzyme trao đổi chất của ty thể
đều đƣợc mã hóa bởi DNA nhân. Các nghiên cứu trên mtDNA đã tím ra vài điểm
khác biệt ở các bộ ba mã hóa acid amin giữa mtDNA và DNA nhân. Vì dụ: UAG
mã hóa cho trytophan chứ khơng phải là bộ ba kết thúc, AGA và AGG là bộ ba kết
thúc chứ khơng phải mã hóa Arginin. Bên cạnh các vùng mã hóa, mtDNA cịn có
cấu trúc
D–Loop (Displacement – Loop) chứa các yếu tố liên quan đến quá trính tái bản và
phiên mã của mtDNA [39].
1.1.2. Cơ chế di truyền của hệ gen ty thể.
Sự nhân đôi của mtDNA: DNA ty thể đƣợc sao chép từ hai điểm khởi đầu.
Sự tái bản DNA bắt đầu từ OH sử dụng một primer RNA tổng hợp từ bản mã sao
của chuỗi nhẹ. Tổng hợp chuỗi nặng đƣợc tiếp tục cho tới hai phần ba vòng của của
phân tử mtDNA, chuỗi mới sẽ thay thế chuỗi nặng ban đầu cho đến khi nó tím đƣợc
điểm khởi đầu của chuỗi nhẹ (OL). Khi đƣợc bộc lộ ra trên chuỗi nặng đã thay thế,
OL cuộn thành cấu trúc vịng móc (stem - loop) và sự tổng hợp chuỗi nhẹ bắt đầu,
tiếp tục quay trở lại dọc theo sợi khuôn H [15].
Sự phiên mã của mtDNA: Phiên mã của mtDNA đƣợc khởi đầu từ 2
promoter trong vùng D-loop. Quá trính phiên mã bắt đầu từ cả 2 promoter (PH, PL)
trong vùng D-loop và liên tục theo mạch vòng của phân tử DNA. Hai sợi phiên mã
theo 2 chiều ngƣợc nhau quanh một vịng để hính thành những phân tử RNA
polycistronic. Các tRNA đựợc tạo thành nhờ ngắt quãng các trính tự dài hơn của
rRNA và mRNA, sau đó chúng đƣợc cuộn xoắn trong các bản phiên mã và đƣợc
phân cắt. Các mRNA và rRNA tự do đƣợc polyadenyl hóa sau phiên mã và tRNA
đƣợc biến đổi thêm CCA vào đầu cuối 3' [15].
Di truyền theo dòng mẹ: Ở hầu hết sinh vật đa bào, mtDNA đƣợc di truyền

từ mẹ (di truyền theo dịng mẹ). Có thể lý giải hiện tƣợng di truyền theo dòng mẹ
của mtDNA nhƣ sau: Một tế bào trứng có khoảng 100.000 đến 1.000.000 phân tử

Đại học Khoa học Tự nhiên

7

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

mtDNA, trong khi một tinh trùng chỉ chứa từ 100 đến 1000 phân tử mtDNA. Trong
sinh sản hữu tình, sau khi thụ tinh, các ty thể trong tinh trùng của động vật có vú sẽ
bị phá hủy bởi chình tế bào trứng, điều đó có nghĩa là trong trứng đã thụ tinh diễn ra
quá trính phân hủy các phân tử mtDNA của tinh trùng. (1) do sự phân hủy protein
phụ thuộc ubiquitin, (2) do hiện tƣợng pha loãng, phân hủy mtDNA của tinh trùng,
(3) do sự khác nhau về trao đổi chất giữa hợp tử và tinh trùng. Tuy nhiên, những cơ
chế này vẫn chƣa phải là những lời giải thìch thoả đáng và thật sự thuyết phục. Bên
cạnh đó, hầu hết ty thể tập trung ở đoạn giữa của đuôi tinh trùng – bộ phận đƣợc coi
là trạm năng lƣợng của tinh trùng, đóng vai trị quan trọng trong q trính di chuyển
của chúng. Đuôi nhiều khả năng bị mất đi trong quá trính thụ tinh. Tuy nhiên, trong
một số nghiên cứu về mtDNA đã đƣợc cơng bố, mtDNA đơi khi có thể đƣợc di truyền
từ bố. Đó là trƣờng hợp gặp ở một số lồi trai, một số lồi cơn trùng nhƣ ruồi giấm, ong
mật, ve sầu [25].
1.1.3. Các rối loạn ty thể [4,53].
Khoảng 90% protein của ty thể
là do DNA nhân mã hóa, chỉ có 10%

protein là do mtDNA tự mã hóa. Nhƣ
vậy, mtDNA chỉ mã hóa cho một số
lƣợng rất ìt protein/enzyme, do đó
chức năng ty thể cịn đƣợc thực hiện
nhờ vào hàng loạt các protein/enzyme
do gen nhân quyết định và đƣợc tổng
hợp trong tế bào chất rồi vận chuyển
đến ty thể [11].

Hình 3: Các bệnh do loạn ty thể [53]

Ví vậy, các rối loạn ty thể (hay bệnh do ty thể) có thể phát sinh do những đột
biến ở gen nhân hoặc gen ty thể (Hình 3). Một số rối loạn ty thể chỉ ảnh hƣởng đến
một cơ quan nhƣng cũng có những rối loạn ảnh hƣởng đến rất nhiều cơ quan và
thƣờng có những đặc điểm nổi trội.

Đại học Khoa học Tự nhiên

8

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

Các rối loạn ty thể do DNA nhân: Những đột biến và thay đổi DNA nhân
thƣờng gây nên hàng loạt những rối loạn ở chuỗi hô hấp nhƣ ảnh hƣởng đến sự hợp
nhất của các enzyme chuỗi hô hấp (chủ yếu là sự thiếu hụt các enzyme trong phức

hệ IV). Những rối loạn này là nguyên nhân của khá nhiều bệnh nhƣ: bệnh loạn
dƣỡng chất trắng và động kinh co giật (Leukodistrophy and myoclonic epylepsy),
bệnh viêm não cơ tim (Cardioencephalomyopathy), bệnh teo thị giác và mất điều
hòa (Optic atrophy and ataxia), hội chứng Leigh (Leigh syndrome) [11].
Các rối loạn ty thể do mtDNA: Cho đến nay có khoảng trên 150 bệnh di
truyền khác nhau theo mẫu hệ do ty thể quyết định. Các bệnh do rối loạn mtDNA
thƣờng đƣợc biểu hiện rất đa dạng. Chúng có thể liên quan đến rối loạn q trính
mã hóa protein hoặc đơn thuần chỉ là những đột biến do thay đổi các nucleotide.
Các rối loạn này có thể chỉ ảnh hƣởng đến một hoặc nhiều cơ quan trên cơ thể với
mức độ biểu hiện khác nhau và có thể xảy ra ở bất cứ lứa tuổi nào [11].
1.2.

ĐỘT BIẾN DNA TY THỂ (MT DNA)  CHỈ THỊ SINH HỌC TIỀM
NĂNG TRONG UNG THƢ.

Hệ gen ty thể ở hầu hết tế bào động vật có vú chứa hàng trăm hoặc hàng
nghín bản sao mtDNA. Do sự vắng mặt của các protein histone, cơ chế bảo vệ và
sửa chữa DNA ở mức độ đơn giản mặt khác mtDNA ở gần những vị trì phát sinh
các gốc tự do (ROS – Reactive Oxygen species), là sản phẩm phụ của quá trính
phosphoryl hóa oxi hóa ở trong ty thể ví vậy so với DNA nhân, mtDNA rất nhạy
cảm với gốc tự do và dễ bị tổn thƣơng hơn và tỷ lệ đột biến do đó cũng cao hơn
(khoảng 17 lần) [11].
1.2.1. Các đột biến trên mtDNA
Các đột biến mtDNA rất đa dạng và gây ra rất nhiều loại bệnh nguy hiểm.
Theo thống kê mới nhất, phân lớn các đột biến trên mtDNA là đột biến điểm, còn
lại là đột biến mất đoạn, đảo đoạn, thêm hay sắp xếp lại. Khoảng 60% đột biến điểm
liên quan đến tRNA ty thể, 35% các đột biến ảnh hƣởng đến các tiểu đơn vị
polypeptide của chuỗi hơ hấp, và 5% cịn lại ảnh hƣởng đến các RNA ribosome ty
thể. Các bệnh liên quan đến đột biến điểm của tRNA ty thể đƣợc biết đến gồm: rối

Đại học Khoa học Tự nhiên

9

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hồng Thị Thùy Dung

loạn phosphoryl hóa oxy hóa, liệt thần kinh thị giác di truyền Lebe – LHON (Lebe
hereditary optic neuropathy), A3243G, T3271C, A3251G gây viêm não tủy nhiễm acid
lactic với các triệu chứng giống đột quỵ (hội chứng MELAS), A8344G, T8356C gây động
kinh co giật cơ (MERRF), A3243G, A4274C gây liệt mắt cơ ngoài tăng tiến kinh niên
(CPEO), hội chứng Leigh, điếc, tiểu đƣờng, thiếu máu sideroblastic, bệnh cơ xƣơng,
bệnh cơ tim, và nhiễm toan ống thận. Các đột biến liên quan đến protein của chuỗi
hô hấp tế bào đƣợc mã hóa bởi mtDNA thƣờng gây ra mất điều hịa, loạn trƣơng lực
cơ, mất trì nhớ, và hội chứng Leigh. Các bệnh liên quan đến đột biến mất đoạn: liệt
mắt tăng tiến kinh niên CPEO (Chronic progressive external ophthalmoplegia), hội
chứng Kearn – Sayre (Kearn – Sayre syndrome, KSS), đái đƣờng và câm điếc
(Diabetes and deafness). Đột biến trong gen cytb gây bệnh không dung nạp vận
động và myoglobin niệu (Exercise intolerance and myoglobutinuria) [36].
Mỗi tế bào chứa hàng trăm hoặc hàng ngàn bản sao mtDNA. Khi phân chia
tế bào các mtDNA đƣợc phân phối ngẫu nhiên trong các tế bào. Trong mơ bính
thƣờng, tất cả các phân tử mtDNA giống hệt nhau (homoplasmy). Đột biến có hại
của mtDNA thƣờng chỉ ảnh hƣởng đến một số bản sao khơng ảnh hƣởng đến tồn
bộ các mtDNA (heteroplasmy). Thơng thƣờng hiê ̣n tƣơ ̣ng đa hin
̀ h lành tin
́ h của

mtDNA là da ̣ng homoplasmic và các đô ̣t biế n gây bê ̣nh là heteroplasmic
hiê ̣n của kiể u hình đô ̣t biế n gây bê ̣nh c

. Sƣ̣ biể u

ó thể thay đổi phụ thuộc vào mức độ

heteroplasmy và nhu cầ u năng lƣơ ̣ng của các mô chiụ ảnh hƣởng

[32]. Mă ̣c dù cơ

chế của sƣ̣ tích lũy các đột biến ty thể trong phát sinh bệnh vẫn còn chƣa thực sự
đƣơ ̣c hi ểu rõ . Nhƣng nhƣ̃ng đô ̣t biế n homoplasmic đã đƣơ ̣c chƣ́ng minh có liên
quan trong nhiề u loa ̣i b ệnh ung thƣ [26]. Các bệnh liên quan đến đột biến mtDNA
gây bệnh chủ yếu đƣợc biểu hiện khi nó đạt đƣợc một tỷ lệ tƣơng đối giữa lƣơng
mtDNA bính thƣờng và lƣợng mtDNA có đột biến trong các mô khác nhau. Cần
một số lƣợng đột biến mtDNA nhất định để có thể gây ra rối loạn chức năng của ty
thể trong một cơ quan cụ thể hoặc mô và tƣ đó phát sinh bệnh trên cá thể (hiệu ứng
ngƣỡng). Sự di truyền của mtDNA tuân theo các quy tắc đặc biệt là di truyền theo
dòng mẹ, phân bào độc lập, hiện tƣợng heteroplasmy và có hiệu ứng ngƣỡng (sự
tìch lũy các đột biến ty thể mới trong tế bào cũng nhƣ trong cơ thể) chình là nguyên

Đại học Khoa học Tự nhiên

10

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

nhân gây bệnh. Nhƣ vậy, Các đột biến mtDNA liên quan đến bệnh cần phải đƣợc
nghiên cứu kỹ về cơ chế đột biến cũng nhƣ ngƣỡng gây bệnh (tỷ lệ heteroplasmy)
của các đột biến nhằm ngăn ngừa bệnh, điều trị hiệu quả và phát hiện các chỉ thị
sinh học nhằm phát hiện bệnh sớm [17].
1.2.2. Mối liên hệ của đột biến mtDNA với bệnh ung thƣ
MtDNA đang trở thành điểm nóng nghiên cứu của di truyền học và y học.
Đột biến mtDNA đã đƣợc ghi nhận có mối liên quan với các dạng bệnh ung thƣ
khác nhau và các dòng tế bào ung thƣ khác nhau, đặc biệt là các loại đột biến điểm.
Các đột biến điểm thƣờng gặp là các loại đột biến thay thế, mất hoặc thêm một số
nucleotid và đột biến ở vùng thiếu ổn định nhƣ đoạn lặp nhỏ vi vệ tinh cả trong
vùng mã hóa và vùng khơng mã hóa [12,14].
Trƣớc khi cơng nghệ giải trính tự DNA đƣợc ứng dụng thí các mtDNA bất
thƣờng trong các tế bào ung thƣ bạch cầu dạng tủy đã đƣợc quan sát. Các đột biến
mtDNA đã đƣợc xác định trong các loại ung thƣ ở ngƣời và phần lớn những đột
biến này tồn tại dƣới dạng tƣơng đồng (homoplastic) trong tự nhiên [17]. Một trong
những nghiên cứu đầu tiên về mtDNA và mối liên quan trong bệnh ung thƣ đã
chứng minh có 7 trong số 10 dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng đƣợc nghiên cứu
biểu hiện đột biến mtDNA [20]. Những đột biến mtDNA này đã đƣợc tím thấy ở
gen mã hóa rRNA (12s và 16s), các tiểu phần của phức hệ I (ND1, ND4L, ND5),
phức hệ III (cytochtome b), phức hệ IV (COXI, COXII, COXIII) và tất cả đều là đột
biến Soma. Tƣơng tự nhƣ vậy, những đột biến mtDNA trong vùng điều khiển D–Loop
có khả năng xảy ra ở bệnh nhân ung thƣ buồng trứng, ung thƣ dạ dày và ung thƣ biểu
mô tế bào gan. Vùng D–Loop bị đột biến là một đoạn poly C (vùng D 310), vùng này
dễ bị tổn thƣơng do các tác nhân oxi hóa hoặc do sự tấn cơng của các chất có ái lực với
điện tử [33].
Cho đến nay, các phân tìch mtDNA đã đƣợc tiến hành trên nhiều loại ung
thƣ khác nhau nhƣ (Hình 4) [13]. Năm 2009, 101 bài báo đƣợc xuất bản trong 10

năm (1998 – 2008) đã đƣợc Lu J và cộng sự thống kê bằng cách sử dụng cơ sở dữ
liệu từ Medline với từ khóa “đột biến mtDNA trong ung thƣ”. Phần lớn các nghiên

Đại học Khoa học Tự nhiên

11

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

cứu về đột biến mtDNA tập trung vùng điều khiển D–Loop và có rất nhiều đột biến
đã đƣợc xác định, đây là khu vực các biến dị đƣợc tìch lũy khá dễ dàng. Ngồi ra,
nhiều đột biến đã đƣợc tím thấy trong gen mã hóa các tiểu đơn vị của phức hệ I
(khoảng 593 đột biến), các gen mã hóa tRNA và rRNA [33].

Hình 4: Một số bệnh ung thư liên quan đến đột biến ty thể [13]
Nhƣ vậy, đột biến mtDNA đóng vai trị nhất định trong sự hính thành và phát
triển ung thƣ. Trong giai đoạn đầu ung thƣ, do sự xâm nhập của các tác nhân gây
ung thƣ hoặc do cơ chế sửa chữa DNA bị sai hỏng gián tiếp đã gây nên các đột biến
ở mtDNA. Theo thời gian, các loại đột biến này đƣợc tìch lũy trong tế bào, mô, và
cơ thể ở trạng thái heteroplasmy và là nguyên nhân tiềm tàng gây bệnh [24]. Nghiên
cứu trên bệnh nhân mắc hội chứng viêm não cơ tim cho thấy đột biến mtDNA đƣợc
tìch lũy đến một mức độ nhất định ở trạng thái heteroplasmy làm tăng tốc độ tiến
triển của khối u, kìch hoạt các tác nhân gây ung thƣ, gia tăng sự mất ổn định trong
hệ gen hoặc cả hai. Trong một vài trƣờng hợp, các đột biến mtDNA gây ra những
khuyết tật nghiêm trọng cho ty thể sẽ bị loại bỏ hoặc giảm bớt tác động của chúng

đến hệ gen. Tuy nhiên, trong các trƣờng hợp khác, những đột biến này là không thể
loại bỏ. Theo giả thuyết Warburg: Trong môi trƣờng thiếu oxi, các tế bào ung thƣ

Đại học Khoa học Tự nhiên

12

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

hấp thụ glucose với tốc độ nhanh hơn những tế bào bính thƣờng, trong khi đó chúng
lại sử dụng tỉ lệ nhỏ hơn glucose trong q trính sản xuất năng lƣợng. Đặc tình
chuyển hóa năng lƣợng độc đáo này làm tế bào ung thƣ tăng trƣởng với tốc độ cực
nhanh. Nhƣ vậy, vào giai đoạn cuối của ung thƣ, các tế bào mang đột biến mtDNA
có thể trở nên chiếm ƣu thế trong các khối u. Nếu những đề xuất trên là chình xác
thí sự có mặt của đột biến mtDNA có thể rất phổ biến trong các bệnh ung thƣ ở giai
đoạn sớm [33].
Ty thể lần đầu tiên đƣợc đề xuất với vai trò tác nhân gây ung thƣ vào năm
1973 khi Shumacher và các cộng sự tiến hành phân tìch số lƣợng và chất lƣợng
mtDNA dƣới kình hiển vi điện tử và tím thấy sự khác biệt trong cấu trúc bào quan
ty thể giữa bệnh nhân ung thƣ và ngƣời bính thƣờng [38]. Họ tiến hành phân tìch
chi tiết hơn trên các mẫu bệnh và phát hiện sự bất ổn định của các đoạn lặp lại ngắn
của mtDNA có liên quan đến ung thƣ. Tiếp đó, các đột biến điểm và mất đoạn đã
đƣợc tím thấy lần đầu tiên bởi cơng nghệ DNA scanning cơng nghệ dị tím kiểm tra
nhiều trính tự một lúc dựa trên đa hính đơn nucleotid SNP và có thêm nhiều biến
thể trính tự đƣợc nhận dạng và báo cáo [23,24].

Mặc dù mối liên quan giữa đột biến mtDNA và các bệnh nhân ung thƣ là khá
lớn nhƣng vai trò của các rối loạn ty thể trong các khối u và sự tác động qua lại của
các gen mã hóa trong nhân và ty thể vẫn chƣa rõ ràng [37]. Đột biến mtDNA đã
đƣợc tím thấy trong ung thƣ đại trực tràng, vú, gan, tuyến tiền liệt, tuyến tụy và
phổi. Bên cạnh đó, các biến thể trính tự đã đƣợc phát hiện trong giai đoạn trƣớc khi
hính thành khối u trong đó đề xuất những đột biến xảy ra sớm trong giai đoạn tiến
triển khối u. Đối với ung thƣ đại trực tràng, 70% dòng tế bào đƣợc khảo sát chứa
các biến thể trính tự trong vùng mã hóa và khơng mã hóa. Sự bất ổn định trong hệ
gen cũng đƣợc tím thấy ở 48% mơ ung thƣ vú và 42 % các mẫu ung thƣ vú có chứa
các biến thể trính tự mtDNA trong vùng điều khiển D – Loop [24].
Năm 2005, Mức độ đột biến (heteroplasmy và homoplasmy) trên các trính tự
trong hệ gen ty thể ở bệnh nhân ung thƣ phổi đã đƣợc NIST (National Institute of
Standards and Technology) phân tìch thống kê sử dụng hệ thống điện di mao dẫn.
Nhằm hỗ trợ mạng lƣới nghiên cứu phát hiện sớm triệu chứng lâm sàng nhằm tím ra

Đại học Khoa học Tự nhiên

13

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hồng Thị Thùy Dung

một cơng cụ phân tử cho ung thƣ phổi. Thơng qua phân tìch đã phát hiện các đột
biến trính tự trong giai đoạn I và IV của khối u. Kết quả này chỉ ra rằng, phƣơng
thức điện di mao dẫn có thể phát hiện ung thƣ ở các bệnh nhân chƣa có triệu chứng
rõ ràng, chẩn đốn khi có triệu chứng xuất hiên, giám sát các bệnh nhân ung thƣ tái

phát hoặc có nguy cơ cao. Nhƣ vây, đột biến mtDNA có thể sử dụng làm chỉ thị
sinh học trong phát hiện và chẩn đốn ung thƣ phổi giai đoạn sớm [24].
Ngồi ra, nhƣ̃ng nghiên cƣ́u gầ n đây chỉ ra có sƣ̣ tƣơng quan giƣ̃a sƣ̣ đa hình
di truyề n của mtDNA với nguy cơ phát triể n ung thƣ trong ung thƣ tuyế n tiề n liê ̣t

,

vòm họng và đa ̣i trƣ̣c tràng. Tấ t cả nhƣ̃ng nghiên cƣ́u hê ̣ gen ty thể cho thấ y hƣ́a he ̣n
to lớn trong tƣơng lai về khả năng cung cấp những ch ỉ thị sinh học ung thƣ nổ i bâ ̣t
[31].
1.2.3. Mối liên quan đột biến mất đoạn của mtDNA với bệnh ung thƣ - chỉ thị
sinh học tiềm năng trong ung thƣ
Đột biến mất đoạn trong hệ gen nói chung cũng nhƣ trong hệ gen ty thể nói
riêng đều gây ra hậu quả nặng nề. Nó dẫn đến sự thay đổi đáng kể cấu trúc của hệ
gen và cuối cùng dẫn đến sự suy giảm chức năng của ty thể, ảnh hƣởng đến quá
trính sinh học của tế bào nhƣ sự bất ổn định nhiễm sắc thể, thay đổi quá trính dẫn
truyền tìn hiệu. Đột biến mất đoạn trên hệ gen của ty thể cũng là một hƣớng nghiên
cứu đƣợc quan tâm. Đột biến mất đoạn trên hệ gen ty thể đƣợc Holt nghiên cứu lân
đầu tiên vào năm 1988. Về sau, các nghiên cứu về đột biết mất đoạn lớn xảy ra
trong hệ gen ty thể đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi chỉ ra rằng đột biến mất đoạn liên
quan đến nhiều bệnh nhƣ liệt mắt tăng tiến kinh niên CPEO (Chronic progressive
external ophthalmoplegia), hội chứng Kearn – Sayre (Kearn – Sayre syndrome,
KSS), hội chứng Pearson (Pearson syndrome – PS ) và q trính lão hóa [8,9,16].
Các đột biến mất đoạn trong hệ gen ty thể phần lớn đƣợc nghiên cứu theo
hƣớng sử dụng phƣơng pháp phân tử xác định các đột biến mất đoạn, sử dụng các
phƣơng pháp định lƣợng nhằm xác định số bản sao đột biến và sử dụng phƣơng
pháp thống kê nhằm tím ra mối liên quan của các đột biến với bệnh ung thƣ. Các
kết quả thu đƣợc liệt kê:

Đại học Khoa học Tự nhiên

14

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

 Năm 1995, Đột biến mất đoạn 50 bp xảy ra trong vùng điều khiển D – Loop
của hệ gen ty thể trong ung thƣ dạ dày [8].
 Đột biến mất đoạn 4977 bp, 3938bp, 4388bp, 4576 bp xuất hiện trong ung
thƣ vú, đặc biệt mất đoạn 4576 bp không xuất hiện trong các mơ vú bính thƣờng,
mà xuất hiện với tần số 13% ở các mơ vú lân cận mơ bính thƣờng và 77% ở các mơ
ung thƣ [42]. Ngồi ra cịn có một số báo cáo liên quan đến số lƣợng bản sao
mtDNA trong các tế bào ung thƣ vú giảm khoảng 63 – 80 % so với các tế bào biểu
mô vú bính thƣờng. Loại đột biến này, đƣợc lặp lại nghiên cứu ở nhiều quốc gia
khác nhau.
 Đột biến mất đoạn 3895 bp xảy ra giữa 2 đoạn trính tự dài 12 bp lặp lại ở hai
đầu tại vị trì 536 – 548 và 4430 – 4442, đoạn mất bao gồm điểm bám mtTF1 trong
vùng điều khiển D – Loop liên quan đến gen tRNA

Met

, các gen mã hóa cho rRNA

12s và rRNA 16s, gen mã hóa cho ND1 của phức hệ I và promoter phiên mã sợi
nặng và sợi nhẹ. Nhƣ vậy, vùng gen bị mất có vai trị rất quan trọng đối với hệ gen
ty thể, có khả năng sẽ tác động trực tiếp đến chức năng của ty thể [23]. Năm 2006,

kỹ thuật Realtime PCR đƣợc các nhà khoa học sử dụng để định lƣợng số bản copy
của đột biến mất đoạn 3895bp trên những vị trì da khác nhau tiếp xúc trực tiếp với
ánh sáng trên cơ thể và các mô da đƣợc lấy ở các vị trì khơng có biểu hiện ác tình
và bệnh nhân ung thƣ da [32]. Nghiên cứu chỉ ra rằng mức độ của đột biến này có
liên quan đến sự phát triển của khối u, cụ thể là tần suất đột biến tăng tỷ lệ thuận với
sự tiếp xúc giữa da và ánh sáng mặt trời (tác nhân gây ung thƣ da). Từ kết quả đó,
nhóm nghiên cứu đã nhận định có thể sử dụng đột biến mất đoạn 3895 bp mtDNA
nhƣ một chỉ thị sinh học để định lƣợng mức độ tiếp xúc của da ngƣời với ánh sáng
mặt trời.
Đột biến mất đoạn 4977 bp của mtDNA (ΔmtDNA4977), đột biến mất đoạn
xảy ra giữa 2 đoạn trính tự dài 13 bp lặp đi lặp lại ở hai đầu tại vị trì 8470–8482 và
13447–13495 là sự thay đổi phổ biến nhất trong mtDNA và đã đƣợc phát hiện trong
một số loại khối u của ngƣời bao gồm cả ung thƣ dạ dày, ung thƣ thực quản, ung
thƣ biểu mô tế bào gan, ung thƣ biểu mô phổi, khối u tuyến giáp [6,22].

Đại học Khoa học Tự nhiên

15

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

Bên cạnh những đột biến mất đoạn phổ biến đã đƣợc nhận dạng, có rất nhiều
mất đoạn độc đáo khác xảy ra trong hệ gen ty thể của tế bào ung thƣ, tuy nhiên cho
đến nay những đột biến mất đoạn độc đáo này vẫn còn là những ẩn số khoa học.
Nhƣ vậy, các đột biến mất đoạn xảy ra phổ biến trong hệ gen ty thể có vai trị nh ất

định đối với nghiên cứu ung thƣ đặc biệt là sự khác nhau về số bản sao (hàm lƣợng)
mtDNA trong tế bào ung thƣ và tế bào bính thƣờng, việc định lƣợng đột biến mất
đoạn mtDNA trong các khối u và dịch cơ thể có thể là những chỉ thị sinh học tiềm
năng trong chẩn đoán và phát hiện ung thƣ ở giai đoạn sớm [23,24,41].
Nhƣ vậy, hiểu biết về vai trò sinh học của ty thể là một trong những mục tiêu
nghiên cứu cơ bản của di truyền học và y học. Việc sử dụng ty thể nhƣ là một chỉ
thị sinh học đang phát triển nhanh chóng trong nhiều ngành khác nhau nhƣ ung thƣ
[41], mtDNA có những đặc điểm phù hợp mtDNA khiế n nó tr ở thành một chỉ thi ̣
sinh ho ̣c di truyề n hấ p dẫn ti

ềm năng cho các nghiên cứu ung thƣ, một hƣớng

nghiên cứu phổ biến trong tƣơng lai : Thƣ́ nhấ t , hệ gen ty thể có kìch thƣớc nhỏ so
với hệ gen nhân với kìch thƣớc 16.569 bp bao gồm 37 gen phân bố dày đặc, tuy
nhiên genome ty thể thiế u intron , thiếu các yêu tố sửa chữa tự bảo vệ, mặt khác lại
nằm gần vị trì phát sinh gốc tự do nên các đô ̣t biế n s ẽ xuất hiện với tần số cao, mức
độ đột biến mtDNA cao gấp 17 lần so với DNA nhân đơn bản, các đột biến xảy ra
sẽ tìch lũy trong vùng mã hóa . Thứ hai, số bản copy cao (từ hàng trăm đến hàng
nghín bản sao mtDNA trong mỗi tế bào) là một ƣu thế so với DNA nhân, tăng khả
năng phát hiện các biến thể trính tự và chuyển vào các mơ cần thiết để phân tìch.
Thứ ba, sự di truyền của hệ gen ty thể độc lập với hệ gen nhân, cấu trúc genome
dạng vòng, xoắn kép, có kìch thƣớc bé tƣơng đối bảo thủ [22]. Mặt khác, đột biến
mtDNA xảy ra thƣờng xuyên trong mô các khối u nguyên phát. Nhƣ vậy, phân tìch
đột biến mtDNA có thể cung cấp một cơng cụ phân tử để phát hiện và tiên lƣợng
ung thƣ trong giai đoạn sớm. Ngày nay, sự tiến bộ của khoa học công nghệ đã cung
cấp một số phƣơng pháp cho phép phát hiện và phân tìch đột biến mtDNA nhanh
chóng với độ tin cậy cao nhƣ microarray, Realtime PCR, ... [14]. Nhƣ vâ ̣y, genome
ty thể là đố i tƣơ ̣ng thích hơ ̣p cho nghiên cƣ́u trong y h ọc nói chung, và là một chỉ
thị sinh học tiềm năng nhằm phát hiện bệnh ung thƣ trong giai đoạn sớm nói riêng.

Đại học Khoa học Tự nhiên

16

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ
1.3.

Hoàng Thị Thùy Dung

UNG THƢ ĐẠI TRỰC TRÀNG VÀ MỐI LIÊN HỆ VỚI ĐỘT BIẾN
MẤT ĐOẠN 4977 BP XẢY RA TRONG DNA TY THỂ

1.3.1. Ung thƣ đại trực tràng
1.3.1.1.

Khái quát về ung thư đại trực tràng

Ung thƣ là một bệnh lý ác tình của tế bào, khi bị kìch thìch bởi các tác nhân
gây ung thƣ, tế bào tăng sinh một cách vô hạn, không theo cơ chế kiểm soát và phát
triển của cơ thể. Các tế bào ung thƣ có thể lan truyền đến các bộ phận khác của cơ
thể qua máu và hệ bạch huyết. Đến nay đã có hơn 200 loại ung thƣ khác nhau đƣợc
biết đến trên cơ thể ngƣời [2]. Các dạng ung thƣ có thể xuất hiện từ nhiều loại mơ
khác nhau của cơ thể và hầu hết đƣợc đặt tên theo cơ quan hoặc loại tế bào, nơi bắt
đầu hính thành ung thƣ. Vì dụ nhƣ ung thƣ bắt đầu trong phổi đƣợc gọi là ung thƣ
phổi, ung thƣ bắt đầu trong gan đƣợc gọi là ung thƣ gan [30].
Ung thƣ đại trực tràng hay còn gọi là ung thƣ ruột kết (colon cancer) là ung
thƣ biểu mô, bao gồm ung thƣ đại tràng và ung thƣ trực tràng. Đại tràng là phần

ruột lớn hính chữ N bao gồm các đoạn ruột kết lên (ascending colon), đoạn ngang
(transverse colon) và đoạn xuống (descending colon). Trực tràng (rectum) là phần
ruột thẳng để chứa phân, nối giữa đại tràng và hậu môn (Hình 5). Ung thƣ thƣờng
xảy ra ở đoạn nối giữa đại tràng và trực tràng, thƣờng hai loại ung thƣ này có liên
hệ với nhau và khó có thể xác định ung thƣ nào xảy ra trƣớc, ung thƣ nào xảy ra sau
ví thế thƣờng đƣợc gọi chung là ung thƣ đại trực tràng [2,29].

Hình 5: Hình ảnh đại trực tràng [57]

Đại học Khoa học Tự nhiên

17

K19 Sinh học


Luận văn thạc sĩ

Hoàng Thị Thùy Dung

Ung thƣ đại trực tràng là một trong những loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế
giới hiện nay, chiếm tỉ lệ cao thứ 3 trong các trƣờng hợp đƣợc chuẩn đoán là do ung
thƣ. Hàng năm, trên thế giới có khoảng 1 triệu ca mắc mới và trên nửa triệu ca tử
vong [40]. Tỉ lệ mắc bệnh khơng giống nhau, ƣớc tình tỉ lệ bệnh nhân ở các nƣớc
phát triển (Mỹ, Nhật) cao gấp 4–10 lần các nƣớc đang phát triển. Trên thực tế, số
lƣợng bệnh nhân ở cả hai nhóm nƣớc đang gia tăng nhanh chóng do sự già hóa dân
số và đời sống ngày càng đƣợc nâng cao. Ung thƣ đại trực tràng thƣờng phát hiện ở
giai đoạn sau 45–50 tuổi, ở tuổi 70 là đa số (khoảng ½ số ngƣời), tuy nhiên bệnh có
xu hƣớng trẻ hóa do chế độ ăn uống, sinh hoạt, sử dụng nhiều rƣợu bia, thuốc lá
[30].

1.3.1.2.

Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng

Ung thƣ đại trực tràng bắt nguồn từ một polyp tuyến khởi sinh. Có 2 dạng polyp
phổ biến ở ung thƣ đại trực tràng là: polyp không phải khối u, không phát sinh ung thƣ
sau này và polyp ác tình, sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ với mức độ loạn sản cao rồi
thành u tuyến lớn và dần hính thành ung thƣ xâm lấn. Tuy nhiên, một vài nghiên cứu
lại cho rằng nguy cơ mắc ung thƣ trực tràng tăng lên ở một số gia đính nhiều thành
viên là do ảnh hƣởng của dạng polyp không phải khối u [21, 35]. Các nhà khoa học chỉ
ra rằng có rất nhiều nguyên nhân hính thành ung thƣ đại trực tràng và tất cả đều dẫn
đến việc biến đổi bệnh học xảy ra ở các tế bào biểu mơ đại trực tràng bính thƣờng.
Thống kê cho thấy có 2 nhóm ngun nhân chình gây ra bệnh này đó là:
 Yếu tố di truyền: Hoạt hóa các gen tiền ung thƣ, bất hoạt các gen ức chế khối
u, sai hỏng trong sửa chữa DNA và di truyền gia đính.
 Yếu tố khơng di truyền: các tác nhân vật lì, hóa học; q trính lão hóa, chế
độ ăn uống ìt xơ, giàu đạm hay thói quen sử dụng bia rƣợu, hút thuốc lá
thƣờng xuyên có thể gây nên những biến đổi trong tế bào biểu mô trực tràng,
gây viêm lt đại tràng.
Ngồi 2 nhóm ngun nhân chình trên cịn có các ngun nhân khác nhƣ
tuổi, giới tình, chủng tộc hay nhiễm vinyl chlorid, anabolic steroid hoặc các rối loạn

Đại học Khoa học Tự nhiên

18

K19 Sinh học