Phân lập và tuyển chọn các chủng aspergillus có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến
Viện Cơng nghệ Sinh học và TS.Nguyễn Nhƣ Ngọc, giảng viên trƣờng Đại học
Lâm Nghiệp, là ngƣời đã hƣớng dẫn, định hƣớng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ
em trong suốt quá trình nghiên cứu làm khóa luận tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn các thầy, cô trong Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại
học Lâm Nghiệp Việt Nam, đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong những
năm em học tập ở đây. Kiến thức đó khơng chỉ là nền tảng, là cơ sở trong quá
trình học tập và nghiên cứu mà còn là hành trang quý báu để em bƣớc vào đời
một cách vững chắc và tự tin nhất.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS.Nguyễn Nhƣ Ngọc đã tạo điều kiện
thuận lợi về phƣơng tiện, hƣớng dẫn em trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè những ngƣời đã
động viên cổ vũ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2018
Sinh Viên

Vũ Thị Mến


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU........................................ 2
1.1. Khái quát về enzyme laccase ......................................................................... 2
1.1.1. Khái niệm .................................................................................................... 2
1.1.2. Cấu tạo của enzyme laccase ........................................................................ 2

1.1.2. Đặc tính enzyme laccase ............................................................................. 3
1.2. Cơ chế hoạt động của enzyme laccase ........................................................... 4
1.3. Ứng dụng của laccase..................................................................................... 6
1.3.1. Ứng dụng của enzyme laccase .................................................................... 6
1.3.2. Xử lý màu thuốc nhuộm .............................................................................. 7
1.3.3. Xử lý sinh học và phân hủy sinh học .......................................................... 7
1.3.4. Tẩy trắng bột giấy ....................................................................................... 7
1.3.5. Các ứng dụng khác ...................................................................................... 8
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc của laccase ................................. 8
1.4.1. Trong nƣớc .................................................................................................. 8
1.4.2. Nƣớc ngoài .................................................................................................. 9
1.5. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase ....................... 10
1.5.1. Trong thực vật ........................................................................................... 10
1.5.2. Trong vi khuẩn và xạ khuẩn ...................................................................... 10
1.5.3. Trong nấm ................................................................................................. 11
1.5.4. Trong côn trùng ......................................................................................... 11
CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 12
2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 12
2.3.Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 12
2.4. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu ....................................................................... 12
2.4.1 Hóa chất và môi trƣờng nuôi cấy ............................................................... 12
2.4.2. Dụng cụ, thiết bị ........................................................................................ 13


2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 14
2.5.1. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc từ gỗ mục .............................................. 14
2.5.2.Phƣơng pháp giữ giống nấm ...................................................................... 14
2.5.3. Định tính sự có mặt của enzyme laccase .................................................. 15
2.5.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm mốc ........................................... 16

2.5.5. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh một số enzyme ngoại bào khác của
nấm đƣợc tuyển chọn .......................................................................................... 16
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 18
3.1. Phân lập, làm thuần tạo bộ sƣu tập các chủng nấm mốc từ gỗ mục ............ 18
3.2. Kết quả thử hoạt tính các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase
............................................................................................................................. 21
3.2.1. Kết quả tuyển chọn enzyme laccase trên cơ chất...................................... 21
3.2.2. Kết quả xác định hoạt tính enzyme laccase ngoại bào trong mơi trƣờng lỏng 23
3.3. Định danh, định tên chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase ... 25
3.3.1. Định danh chủng nấm CN1 ....................................................................... 25
3.3.2. Định danh chủng nấm CN2 ....................................................................... 26
3.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh một số enzyme ngoại bào khác của
nấm đƣợc tuyển chọn .......................................................................................... 27
3.4.1. Khả năng phân giải tinh bột của nấm mốc ................................................ 27
3.4.2. Khả năng phân giải cellulose của nấm mốc .............................................. 28
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................... 29
4.1. Kết luận ........................................................................................................ 29
4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 30


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ................................................ 14
Bảng 3.1. Hình thái khuẩn lạc một số chủng nấm mốc phân lập đƣợc .............. 18
Bảng 3.2. Đƣờng kính vịng xuất hiện phản ứng màu laccase của các chủng nấm
mốc ...................................................................................................................... 22
Bảng 3.3. Đƣờng kính vịng xuất hiện phản ứng màu laccase............................ 24
Bảng 3.4. Đƣờng kính vịng phân giải tinh bột của chủng nấm CN1,CN2 ........ 27
Bảng 3.5. Đƣờng kính vịng phân giải cellulose của chủng nấm CN1,CN2 ...... 28

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc khơng gian enzyme laccase ..................................... 3
Hình 1.2. Hình ảnh trung tâm hoạt động của laccase ........................................... 3
Hình1.3. Cơ chế phản ứng của enzyme laccase .................................................... 6
Hình 3.1. Một số chủng nấm mốc đƣợc giữ giống ............................................. 21
Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính enzyme laccase trên cơ chất ............................. 23
Hình 3.3. Enzyme trong mơi trƣờng lỏng ........................................................... 24
Hình 3.4. Vịng phân giải acid tanic của các chủng nấm .................................... 24
Hình 3.5. Hình thái nấm và cơ quan sinh sản của CN1 ...................................... 25
Hình 3.6. Hình thái nấm và cơ quan sinh sản của CN2 ...................................... 26


DANH MỤC VIẾT TẮT
PCB

Polychlorinated biphenyl

EPR

Lò phản ứng hạt nhân

LB

Luria Bertani

SNA

Agar Spezieller Nahrstoffarmer

ABTS

Axit 2,2’-azino-bis 3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic


MỞ ĐẦU
Việc sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống ngày càng đƣợc nhiều nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu và thực tế cho thấy chế phẩm enzyme đang đƣợc
sử dụng phổ biến ở nhiều nƣớc đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn, đặc biệt các
enzyme có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đa vòng. Điển hình trong số
đó là enzyme laccase. Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme lignolytic
và là một polyphenol oxydase, do đó có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp
chất có liên quan. Ƣu điểm vƣợt trội của laccase là có tính oxy hóa mạnh,
laccase đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, trong xử lý
phụ phẩm nông nghiệp và nguồn nƣớc thải ô nhiễm. Laccase còn đƣợc biết đến
nhƣ một enzyme thân thiện với môi trƣờng do trong phản ứng laccase chỉ cần
lấy oxy từ khơng khí và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sau phản ứng là nƣớc
Laccase có thể đƣợc thu từ các nguồn khác nhau nhƣ nấm mốc, thực vật, vi
khuẩn, côn trùng nhƣng phổ biến nhất là từ nấm mốc. Hiện nay nhiều chủng
nấm sợi đã đƣợc phát hiện khả năng tổng hợp laccase cao nhƣ: Trametes
versicolor[2], Melanocarpus albomyces, Trametes modesta [4]. Hơn nữa, nấm
mốc có khả năng sinh trƣởng phát triển mạnh nên thuận lợi rất nhiều cho việc
sản xuất laccase ở quy mô lớn phục vụ trong công nghiệp và đời sống.
Trong những năm gần đây, laccase đƣợc ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác
nhau nhƣ tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, chế biến thực phẩm
thơng qua việc đƣa vào các quy trình xử lý sinh học. Ngồi ra, laccase cịn đƣợc
sử dụng trong tổng hợp chất hữu cơ, xử lý các nguồn nƣớc thải bị ô nhiễm bằng
việc loại bỏ các hợp chất phenol, xử lý phụ phẩm nông nghiệp để tạo nguyên
liệu cho các quá trình khác. Ứng dụng của laccase đƣợc mở rộng bằng việc kết
hợp laccase với các mediator (chất trung gian) làm chúng có khả năng oxy hóa

những hợp chất khơng có bản chất phenol (non-phenol).
Với các vấn đề cấp thiết về nguồn enzyme laccase nên tôi đã tiến hành đề
tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp
enzyme laccase”. Để có thể tăng thêm số lƣợng các chủng có khả năng sinh
enzyme laccase phục vụ cho đời sống con ngƣời.

1


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1.Khái quát về enzyme laccase
1.1.1. Khái niệm
Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme lignolytic có khả năng oxy
hóa mạnh các hợp chất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, lignin,
dioxin,...và phân giải các hợp chất vô cơ nhƣ iot [5].
Laccase đƣợc ký hiệu là p- benzenediol: oxygen oxidoreductase (EC
1.10.3.2) và là một polyphenol oxidase có chứa nhiều nguyên tử đồng trong
trung tâm hoạt động [5].
1.1.2. Cấu tạo của enzyme laccase
Nguyên tử đồng có chứa 1,4-benzenediol: oxy oxidoreductases. Chúng
khác nhau về trình tự axit amin và một số tính chất về động học xúc tác [6].
Laccases chứa 4 nguyên tử đồng đƣợc gọi là nguyên tử đồng T1 (nơi chất
nền giảm liên kết) và cụm nguyên tử đồng T2 / T3 (nơi oxy liên kết và giảm
xuống nƣớc) [8].
Ba loại đồng đƣợc phân biệt bằng cách sử dụng quang phổ UV có thể nhìn
thấy đƣợc và quang điện cộng hƣởng (EPR). Nguyên tử đồng T1 chịu trách
nhiệm về màu xanh của protein và có thể phát hiện EPR. Nguyên tử đồng loại
T2 không thay đổi màu sắc nhƣng có thể phát hiện EPR. Nguyên tử đồngT3
gồm một cặp ngun tử đồng khơng phát hiện tín hiệu EPR [8].

Năm 1894 Gabrie Bertrand lần đầu tiên nghiên cứu laccase trong nhựa
cây sơn mài Nhật Bản, đây là nơi nó giúp tạo thành sơn mài [16].

2


Hình 1.1. Hình ảnh cấu trúc khơng gian enzyme laccase

Hình 1.2. Hình ảnh trung tâm hoạt động của laccase
1.1.2. Đặc tính enzyme laccase
Các nguyên tử đồng loại 1, loại 2, loại 3 trong enzyme laccase bị ràng buộc
ở một số khu vực. Nguyên tử đồng loại 2 và loại 3 đƣợc gọi là một cụm
trinuclear. Nguyên tử đồng loại 1 có sẵn để hoạt động dung mơi, chẳng hạn nhƣ
nƣớc. Nó có thể đƣợc di chuyển bằng thủy ngân, đƣợc thay thế bởi coban hoặc
3


loại bỏ qua một phức hợp đồng. Loại bỏ đồng loại 1 làm giảm hoạt động của
laccase [21].
Tính chất hóa sinh của enzyme laccase: trọng lƣợng phân tử, pH, nhiệt độ
tối ƣu, nguồn carbon nito,...
Trọng lƣợng: Năm 1998 Judewicz và cộng sự đã ƣớc tính đƣợc trọng
lƣợng phân tử của enzyme laccase Cerrena unicolor là 59 kDa [9].
Ảnh hƣởng của pH: laccase hoạt động tốt trong khoảng pH 3 – 8, khi tăng
hoặc giảm pH sẽ làm ức chế hoạt tính laccase do ion hydroxide. Hoạt tính của
enzyme laccase ở các pH khác nhau vì sự tăng chênh lệch thể oxi hóa khử và tác
dụng ức chế trong nguyên tử đồng 3 của ion hydroxide [7].
Ảnh hƣởng của nhiệt độ: Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ
thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật. Nhìn chung, laccase bền ở 30oC– 50oC và
nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 60oC. Laccase bền nhiệt nhất đƣợc

phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote [10].
Ảnh hƣởng của nguồn Carbon và Nitơ: Hệ thống lignolytic của nấm thối
trắng đƣợc kích hoạt trong giai đoạn chuyển hóa thứ cấp của nấm và đƣợc kích
hoạt bởi sự suy giảm nitơ. Các nguồn carbon dƣ thừa sẽ cản trở sự phát triển
enzyme. Một số ảnh hƣởng khác: Các chất ức chếnhƣ axit amin, axit béo,
florua,... Laccase gây ức chế hoạt động của enzyme bằng cách liên kết với
nguyên tử đồng loại 2 hoặc 3, dẫn đến sự gián đoạn quá trình truyền electron
bên trong (các ion kim loại nhƣ halogenua azide, xyanua), biến đổi axit amin
thay đổi cấu hình của Cu chelation (ion kim loại, axit béo), loại bỏ chọn lọc
nguyên tử đồng bằng dimethyl glyoxime.
Năm 2009 Valeriano và cộng sự tìm thấy là hoạt động của laccase tinh
khiết từ Stereum ostrea và ổn định ở pH tối ƣu 6.0 và nhiệt độ 40°C [11].
1.2.Cơ chế hoạt động của enzyme laccase
Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp
chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Sự phù hợp của
các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính. Thứ nhất là sự phù
4


hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào sự chênh
lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme. Các đại lƣợng này phụ thuộc
cấu trúc hóa học của cơ chất. Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong
khoảng 0,4 đến 0,8 V [9]. Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccase
thƣờng tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa
nhờ xúc tác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục cácphản ứng khơng cần xúc tác
enzyme nhƣ hydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa [8].
Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy
hóa cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử
đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên
tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận

chuyển đồng thời 4 electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng
T2/T3 qua cầu tripeptide bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hóa
laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử
thành nƣớc.
Nguyên tử đồng T1 đƣợc giảm bởi một chất nền, do đó T1 bị oxy
hóa. Điện tử sau đó đƣợc chuyển từ T1 đến một cụm trinuclear đƣợc tạo thành
từ các nguyên tử đồng T2 và T3 (Hình 3). Phân tử O2liên kết với cụm trinuclear
đểkích hoạt bất đối xứng và nó đƣợc mơ phỏng rằng túi liên kết O2 dƣờng nhƣ
hạn chế sự tiếp cận của các tác nhân oxy hóa khác với O2. Khi một q trình oxy
hóa chất nền điện tử đƣợc kết hợp với sự giảm oxy bốn electron, cơ chế phản
ứng khơng thể hồn tồn đơn giản. Laccase có thể đƣợc cho là hoạt động nhƣ
một pin, lƣu trữ các điện tử từ các phản ứng oxy hóa riêng lẻ để giảm oxy phân
tử. Do đó, q trình oxy hóa của bốn phân tử chất nền giảm là cần thiết để giảm
hoàn toàn oxy phân tử thành nƣớc.

5


Hình1.3. Cơ chế phản ứng của enzyme laccase
Chất nền oxy hóa bằng laccase là phản ứng một electron tạo ra gốc tự
do. Sự suy giảm lignin bởi gốc phenoxy dẫn đến sự oxy hóa ở Cα-carbon hoặc
sự phân cắt liên kết giữa Cα-carbon và Cβ-carbon. Sự oxy hóa này dẫn đến một
gốc tự do lấy oxy làm trung tâm, sau đó có thể đƣợc chuyển đổi thành phản ứng
xúc tác enzyme thứ hai thành quinine (hợp chất thơm). Quinone và các gốc tự
do có thể trải qua q trình trùng hợp [8,11]Sự có mặt của các nhóm thế điện tử
thu hồi ở nhóm phenoxy và các nhóm cồng kềnh khó bị oxy hóa hơn [8].
Chất trung gian tổng hợp phổ biến là 2,2'-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline6-sulfonate) (ABTS) và acid hydroxyanthranilic 3. Trong sự có mặt của oxy
ABTS mức độ hấp thụ bởi laccase nhanh hơn HOBT [15,22].
1.3. Ứng dụng của laccase
1.3.1. Ứng dụng của enzyme laccase

Enzyme laccase là loại enzyme quan trọng vì nó oxy hố cả các chất độc
và khơng độc hại. Nó đƣợc sử dụng trong cơng nghiệp dệt, cơng nghiệp chế biến
thực phẩm, công nghiệp chế biến gỗ, công nghiệp dƣợc phẩm và cơng nghiệp
hóa chất,...

6


1.3.2. Xử lý màu thuốc nhuộm
Ngành công nghiệp dệt sử dụng khối lƣợng lớn nƣớc và hóa chất để sản
xuất. Những hóa chất này từ các hợp chất vơ cơ và hợp chất hữu cơ. Cấu trúc
hóa học của thuốc nhuộm cung cấp khả năng chống phai khi tiếp xúc với ánh
sáng, nƣớc và các hóa chất khác.
Năm 2008 Dube và cộng sự đã thử hoạt tính khử màu một số thuốc nhuộm
tổng hợp (xanh methylen, methyl xanh, toluidin xanh, đỏ Congo, methyl cam và
hồng) và nƣớc thải công nghiệp (SITEX Black) đạt đƣợc nhờ vi khuẩn S.
maltophilia AAP56 trong môi trƣờng tăng trƣởng LB [12].
1.3.3. Xử lý sinh học và phân hủy sinh học
Laccases cũng cho thấy hữu ích cho việc loại bỏ các hợp chất độc hại thông
qua enzym oxy hóa ghép các chất gây ơ nhiễm, dẫn đến các cấu trúc phức tạp
khơng hịa tan [13]. Các hợp chất phenolic có mặt trong chất thải từ một số q
trình cơng nghiệp, nhƣ chuyển đổi than, tinh chế dầu mỏ, sản xuất hóa chất hữu
cơ và sản xuất dầu ô liu trong số những ngƣời khác [14].
Laccase cố định đƣợc chính minh loại bỏ phenolic và clo hóa chất gây ô
nhiễm phenolic một cách hiệu quả [18]. Laccase có vai trị chuyển đổi 2,4,6trichlorophenol

thành

2,6-dichloro-1,4-hydroquinol

và

2,6-dichloro-1,4-

benzoquinone [15]. Một số tác giả thấy rằng nấm thối trắng có thể oxy hóa các
chất alken, carbazole, N-ethylcarbazole, fluorene và dibenzothiophene khi có
mặt HBT và ABTS làm trung gian [16]
1.3.4. Tẩy trắng bột giấy
Trong q trình chuẩn bị cơng nghiệp giấy, việc tách và phân hủy lignin
thƣờng đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng Cl2 và O3. Tuy nhiên trong những
năm qua ngƣời ta đã dùng laccase thay cho các hợt chất của Cl để àm trắng giấy.
Mặc dù đây là một phƣơng pháp mới, nhƣng quá trình sử dụng laccase vẫn thể
hiện đƣợc tính hiệu quả bởi vì q trình hoạt động trong điều kiện nhẹ hơn sạch hơn
và mặc dù phân hủy lignin nhƣng vẫn giữ đƣợc sự tròn vẹn của cellulose. Nếu khơng
giữ đƣợc sự trịn vẹn của cellulose sẽ khơng làm đƣợc giấy.
7


1.3.5. Các ứng dụng khác
Trong ngành công nghiệp thực phẩm, laccase đƣợc sử dụng để loại bỏ các
hợp chất phenolic khơng mong muốn trong q trình nƣớng, xử lý nƣớc trái cây,
ổn định rƣợu và xử lý sinh học nƣớc thải. Laccase cải thiện khơng chỉ tính năng
mà cịn cả các đặc tính cảm giác [18].
Laccase cung cấp sự ổn định mà còn tăng tuổi thọ của bia. Để cải thiện kết
cấu, khối lƣợng, hƣơng vị và độ tƣơi của bánh mì, nhiều loại enzym đƣợc sử
dụng. Khi laccase đƣợc thêm vào bột, sức mạnh của cấu trúc gluten trong bột và
các sản phẩm nƣớng đƣợc cải thiện: tăng khối lƣợng sản phẩm, cải thiện cấu
trúc crumb, và sự mềm mại của các sản phẩm nƣớng diễn ra [19].
Laccase có khả năng làm giảm mùi hôi phát sinh từ các bãi chôn lấp, trang
trại chăn nuôi và các nhà máy bột giấy. Do các chất kết tụ xúc tác các phản ứng

truyền điện tử mà khơng có các điều kiện bổ sung, chúng cũng có thể đƣợc sử
dụng nhƣ là các cảm biến sinh học để phát hiện các hợp chất phenol khác nhau,
oxy và azide. Ngồi ra laccase có thể phát hiện morphine, codeine,
catecholamine, ƣớc tính phenol hoặc các enzyme khác trong nƣớc trái cây và
flavonoid thực vật [17].
Laccases có thể đƣợc sử dụng để giải độc các loại đất có chứa các chất ơ
nhiễm phenolic và các chất độc do thuốc trừ sâu,... do phạm vi bề mặt rộng của
enzyme.
Năm 2009 Đào Thị Ngọc Ánh đã nghiên cứu phân loại, khả năng phân hủy
DDT và sinh laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc
trừ sâu nhằm xử lý đất ơ nhiễm có thuốc trừ sâu làm cho đất khơng cịn bị ơ
nhiễm nữa.
1.4.Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc của laccase
1.4.1. Trong nước

8


Ở nƣớc ta hiện nay việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không
nhiều nhƣ các nƣớc phát triển khác. Tuy nhiên việc đƣa các nghiên cứu và ứng
dụng của quá trình xử lý các hợp chất đang đƣợc các nhà nghiên cứu khoa học
tiến hành từ lâu đời.
Năm 2009 Đào Thị Ngọc Ánh đã “Nghiên cứu phân loại, khả năng phân
hủy DDT và sinh laccase của chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp
thuốc trừ sâu”. Kết quả đạt đƣợc các chủng nấm Aspergillus sp phân hủy DDT
theo cơ chế đồng trao đổi chất, sau 7 ngày Aspergillus sp sẽ loại bỏ DDE, DDD
và DDT lần lƣợt là 92,69 %, 97,19 % và 97,23 %. Aspergillus sp không phát
triển trên nguồn carbon là lactose và cellulose, phát triển yếu trên nguồn nitơ là
Aspergillus sp. sinh tổng hợp laccase trong điều kiện 30oC, pH.
Năm 2013 Dƣơng Minh Lam, Trƣơng Thị Chiên với đề tài “Nghiên cứu

một sốđặc tính sinh học của chủng nấm đảm trametes maxima cpb30 sinh
laccase ứng dụng trong xử lí màu nƣớc ô nhiễm do thuốc nhuộm”. Kết quả đạt
đƣợc là Chủng T. maxima CPB30 là chủng ƣa ấm, sinh trƣởng và sinh laccase
tốt nhất ở 30oC. Giá trị pH ban ñầu của môi trƣờng tốt nhất cho sinh trƣởng và
sinh laccase là 2,5-3,0. Enzyme laccase từ T. maxima CPB30 hoạt động mạnh
nhất tại 50oC và có khả năng oxi hóa khử màu thuốc nhuộm vải trong thời gian
ngắn ở nồng độ 2,5% dịch enzyme 1000U/ml.
Năm 2015 Đinh Thị Thu Hằng và các cộng sự đã “Nghiên cứu khả năng loại
màu thuốc nhuộm bởi laccase sinh tổng hợp từ chủng nấm đảm Pycnoporus sp.
fbv60 phân lập từBa Vì”. Kết quả đạt đƣợc chủng phân lập làPycnoporus
coccineus ứng dụng trong khử độc các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm bằng phân
hủy sinh học, là loại màu thuốc nhuộm ở các cơ sở dệt nhuộm qui mơ cơng
nghiệp [20].
1.4.2. Nước ngồi
Trong những năm gần đây, các enzym đã đạt đƣợc tầm quan trọng lớn trong
ngành công nghiệp; laccases là một trong số chúng có mặt rộng rãi trong tự nhiên. Vì
thế enzyme laccase đã đƣợc các nhà nghiên cứu về ứng dụng của nó.
9


Năm 2015 Ursula fillat và cộng sự đã nghiên cứu “Biobleaching of orange
tree pruning cellulose pulp with xylanase and laccase mediator systems” đã đạt
đƣợc sự kết hợp của laccase từ T.Villosa với acetosyringone LMS làm tăng tính
chất quang học của giấy tẩy trắng [16].
Năm 2008 Dube và cộng sự quan sát thấy axít tetraacetic ethylene diamine
(EDTA)(5 mM) hồn tồn ức chế hoạt động của laccase. EDTA, SDS và
arginine có tác dụng ức chế nổi mạnh nhất đối với hoạt động của laccase [4].
Năm 2017 Amit Kumar và cộng sự đã thanh lọc dựa trên gel và nghiên cứu
sinh hóa của Isozym Laccase sản xuất từ Ganoderma sp. Kết quả đạt đƣợc các
isozyme laccase từ G. Lucidum đã đƣợc tìm thấy có vai trị chống oxy hóa và do

đó có khả năng trong các gốc tự do nhặt rác trong quá trình sinh bệnh. Đây là
nghiên cứu chi tiết đầu tiên về đặc điểm sinh hóa của tất cả các isozyme laccase
đƣợc tinh chế bằng phƣơng pháp mới dựa trên gel.
1.5. Sự phân bố của laccase và vi sinh vật sinh enzyme laccase
Laccase rất phổ biến trong tự nhiên, chúng đƣợc tìm thấy ở thực vật, nấm,
một số vi khuẩn và côn trùng.
1.5.1. Trong thực vật
Laccase lần đầu tiên đƣợc phát hiện đầu tiên ở cây Rhus vernicifera,
laccases đƣợc tìm thấy trong cải bắp, củ cải, khoai tây, lê, táo và các loại rau
khác. Chúng đã đƣợc phân lập từ nấm Ascomyceteous,Deuteromycteous và
Basidiomycetous với hơn 60 chủng nấm [13].
1.5.2. Trong vi khuẩn và xạ khuẩn
Nguồn laccase từ vi khuẩn thƣờng lấy từ đất, nƣớc thải dệt, chất thải đô thị, vỏ
cây, một số loại nấm sản xuất lacier thuộc lớp Ascomycete và Basidiomycete cũng
đƣợc

phân

lập

là

Coriolopsis

byrsina, Cerrena

unicolor, Diaporthe

phaseolorum , Pestalotiopsis uvicola là nấm có nguồn gốc từ biển. Các vi khuẩn sản
xuất laccase quan trọng nhƣ Bacillussubtilis, Azospirillum lipoferum, Streptomyces

coelicolor,...
10


Xạ khuẩn: streptomyces,...

1.5.3. Trong nấm
Laccase từ nấm đƣợc nghiên cứu và khảo sát rất kỹ đặc biệt là laccase từ
nấm đảm Basidomyces, ngồi ra cịn có các nấm nhƣ Ascomyces,
Deuteromyces, basidomyces,...
Nấm Basidiomycetes màu trắng thối có hiệu quả làm suy giảm lignin so với
Ascomycetes và Deuteromycetes làm oxy hóa các hợp chất phenolic để tạo ra
các gốc phenoxy và quinin [14].
1.5.4. Trong cơn trùng
Laccase đã đƣợc tìm thấy trong lớp biểu bì của nhiều lồi cơn trùng từ
nhộng tằm, lớp biểu bì của bọ cánh cứng màu đỏ, Tribolium castaneum. Gần
đây, một laccase trong tuyến nƣớc bọt của N. Cincticeps [4].

11


CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
laccase từ rừng núi Luốt.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu gỗ thu thập từ rừng ở
núi Luốt.
- Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp laccase cao.

- Xác định sơ bộ các đặc điểm sinh hóa của chủng nấm tuyển chọn.
- Xác định khả năng sinh một số enzyme ngoại bào khác của nấm đƣợc
tuyển chọn.
2.3.Vật liệu nghiên cứu
Các đoạn gỗ mục, sợi tơ nấm bám trên gỗ ở núi Luốt Trƣờng Đại học Lâm
Nghiệp.
2.4. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm là hóa chất thơng dụng trong phịng
thí nghiệm nhƣ: C72H56O46, KH2PO4, KNO3, MgSO4.7H2O, KCl, glucose, agar,
CMC, tinh bột, cogo red,...
2.4.1 Hóa chất và mơi trường ni cấy
2.4.1.1. Hóa chất sử dụng
Hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm là hóa chất thơng dụng trong phịng thí
nghiệm nhƣ: C72H56O46, KH2PO4, KNO3, MgSO4.7H2O, KCl, glucose, agar,
CMC, tinh bột, cogo red,...
2.4.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
- Môi trƣờng thạch PDA dùng để phân lập nấm
Hóa chất

g/l

Dịch chiết khoai tây

200

Glucose

20

Agar

20

Kháng sinh Chloramphenicol

2

12


- Môi trƣờng giữ giống SNA dùng để cất giữ giống
Hóa chất

g/l
KH2PO4
1
KNO3
1
MgSO4.7H2O
0,5
KCl
0,5
Glucose
0,2
Sacarose
0,2
Agar
15
- Mơi trƣờng định tính Laccase là mơi trƣờng tuyển chọn chủng nấm có
khả năng sinh enzyme laccase

Hóa chất
Dịch chiết khoai tây
Glucose
Agar
Acid Tannic
- Mơi trƣờng PDB lỏng

g/l
200
20
20
0,4 - 0,8%

Hóa chất
g/l
Dịch chiết khoai tây
200
Glucose
20
- Môi trƣờng phân giải tinh bột hoạt tính enzyme laccase qua vịng phân giải
Hóa chất
Agar
Tinh bột
- Mơi trƣờng phân giải cellulase
Hóa chất
Agar
CMC(mặn, ngọt)
2.4.2. Dụng cụ, thiết bị

g/l

15
0,5%
g/l
15
0,5%

Dụng cụ, thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là các loại máy móc, trang
thiết bị có ở phịng thí nghiệm của Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện
Cơng nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, gồm:
- Dụng cụ:
+ Ống nghiệm, bình tam giác, đĩa petri;
+ Cốc đong, ống đong, ống fancol, ống effendof;
+ Đầu côn;
13


+ Một số dụng cụ khác.
- Thiết bị sử dụng:
Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
STT

Tên thiết bị

Xuất xứ

STT

Tên thiết bị

Xuất xứ

1

Box vô trùng

Mỹ

6

Bếp điện/ bếp từ

Hàn Quốc

2

Tủ ấm

Trung Quốc

7

Tủ lạnh

Nhật

3

Nồi hấp khử trùng

Trung Quốc

8

Máy lắc

Hàn Quốc

4

Cân điện tử

Anh

9

Tủ sấy

Đức

Lị vi sóng

Mỹ

10

5

Kính hiểm vi
quang học

Đức

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp phân lập nấm mốc từ gỗ mục
- Lấy mẫu và phân lập mốc từ gỗ mục
+ Mẫu nấm đƣợc thu trên các thân cây gỗ mục từ núi Luốt Trƣờng Đại học
Lâm Nghiệp và đƣợc giữ trong các túi nylon vô trùng khác nhau. Ghi tên mẫu,
đánh số thứ tự các vị trí lấy. Tại phịng thí nghiệm, các mẫu chƣa phân tích ngay
sẽ đƣợc bảo quản ở 4oC.
+ Tạo ra các khuẩn lạc nấm riêng rẽ từ các mẩu gỗ mục.
- Tiến hành
+ Các mẫu gỗ mục đƣợc rửa bằng nƣớc sạch, dùng dao vô trùng cắt gỗ mục
thành các mảnh nhỏ và đƣợc rửa lại qua nƣớc cất khử trùng.
+ Dùng que cấy vô trùng lấy sợi nấm bám trên gỗ cấy trực tiếp lên môi
trƣờng thạch PDA (bổ sung kháng sinh Chloramphenicol 0,2%)
+ Nấm đƣợc nuôi ở nhiệt độ 30oC sau 2 -5 ngày.
Sau đó làm thuần nấm bằng cách tiếp tục cấy truyền các tản nấm trên bề
mặt mơi trƣờng PDA có bổ sung chloramphenicol từ 2 - 3 lần.
2.5.2.Phương pháp giữ giống nấm

14


Các chủng nấm mốc sau khi đã làm thuần đƣợc cấy trên môi trƣờng giữ
giống SNA trong ống thạch nghiêng và kí hiệu. Sau 2-7 ngày ở 30oC cất giữ
giống cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.5.3. Định tính sự có mặt của enzyme laccase
2.5.3.1. Định tính sự có mặt của enzyme laccase bằng chất đệm
- Nguyên tắc
Axit tanic là cơ chất đƣợc sử dụng để thử định tính về khả năng tổng hợp

các loại enzyme phân giải lignin của các chủng nấm mốc đã phân lập đƣợc.
Dựa trên sự biến đổi màu sắc của các chủng nấm trên môi trƣờng thử hoạt
tính laccase thấy đƣợc phản ứng xuất hiện màu khi môi trƣờng xung quanh
chủng nấm mốc chuyễn sang màu thẫm.
- Tiến hành
+ Môi trƣờng PDA đƣợc bổ sung axit tanic với nồng độ 0,5% pha loãng với
10 ml nƣớc cất và đổ vào môi trƣờng PDA (70oC) và lắc đều.
+ Dùng que cấy, cấy các chủng nấm mốc thành từng điểm trên bề mặt môi
trƣờng.
+ Nuôi ở tủ ấm nhiệt độ 30oC sau 2 -5 ngày.
Đo đƣờng kính vịng xuất hiện phản ứng màu acid tanic theo công thức D/d
mm
2.5.3.2. Định tính sự có mặt enzyme laccase bằng phương pháp đục lỗ thạch
- Tiến hành
+ Dùng que cấy lấy sợi nấm của mỗi loại cấy vào môi trƣờng lỏng PDB.
Ni nấm ở 30oC và lắc 150 vịng/phút, ni 24 giờ.
Tiến hành thu dịch trong các bình tam giác để thử hoạt tính trên mơi trƣờng
thạch bổ sung axit tannic (0,5%).
+ Hút 1ml dịch vào ống eppendorf và đem đi ly tâm ở 4oC, 1000 vòng/phút
trong 5 phút thu dịch.

15


+ Khoan các lỗ trên mơi trƣờng thử hoạt tính, nhỏ vào một lỗ khoan 100 µm
dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, sau đó cho vào tủ ấm ở 30oC trong 24 giờ.
Đo đƣờng kính vịng xuất hiện phản ứng màu acid tanic (D – d) mm
Trong đó:
D: đƣờng kính vịng xuất hiện phản ứng màu cơ chất acid tanic (mm)
d: đƣờng kính lỗ thạch (d = 8 mm)

2.5.4. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm mốc
Nghiên cứu tên chủng nấm theo Hệ nấm mốc ở Việt nam – TS. Đặng Vũ
Hồng Miên [2].
Quan sát trực tiếp chủng nấm mốc trên môi trƣờng PDA bằng mắt thƣờng
và quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Các đặc điểm hình thái của thể sinh
bào tử nhƣ hình thái khuẩn lạc, màu sắc, đƣờng kính khuẩn lạc, cấu tạo cơ quan
sinh sản,...
- Tiến hành
Nhuộm tiêu bản bằng xanh methylen
+ Lấy sợi nấm lên lam kính và cố định mẫu bằng lửa đèn cồn.
+ Nhỏ 3 giọt xanh methylen vào mẫu.
+ Rửa bằng cồn trong 10 giây.
+ Rửa nƣớc cất, để khô.
Quan sát cơ quan sinh sản nấm trên kinh hiểm vi.
2.5.5. Phương pháp xác định khả năng sinh một số enzyme ngoại bào khác
của nấm được tuyển chọn
2.5.5.1. Khả năng phân giải tinh bột
- Nguyên tắc
Tinh bột là chất dự trữ quan trọng của thực vật. Tinh bột là một loại
polisaccarit đƣợc cấu tạo bởi 2 thành phần là amyloza và amylopectin. Amyloza
tan trong nƣớc nóng, chiếm khoảng 25% trong tinh bột.
- Tiến hành:
+ Dùng mơi trƣờng có chứa tinh bột đổ ra đĩa thạch và đục lỗ thạch với
đƣờng kính của các lỗ thạch là 8 mm.
16


+ Hút dịch enzyme lỏng vào các ống eppendorf ly tâm và tra vào lỗ thạch.
Giữ mẫu trong tủ lạnh 4oC 2 giờ cho enzyme khuếch tán vào môi trƣờng.
+ Tiếp theo ủ ở 30oC trong 24giờ.

+ Sau 24 giờ cho lugol vào đĩa trong 10 phút sau đó rửa sạch với NaCl 1M.
rửa sạch.
Đo đƣờng kính vịng phân giải tinh bột rồi xác định khả năng thủy phân
tinh bột theo cơng thức (D – d) mm
Trong đó:
D: đƣờng kính vịng phân giải tinh bột (mm)
d: đƣờng kính lỗ thạch (d = 10 mm)
Quan sát và đo đƣờng kính các vòng phân giải.
2.5.5.1. Khả năng phân giải cellulose
Xác định nhanh khả năng phân giải cellulose qua kiểm tra vòng phân giải
CMC bằng thuốc nhuộm Congo red.
- Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này chủ yếu dựa trên các liên kết của Cogo red với P- nguyên
vẹn trong carboxymethyl cellulose. Endo-glucanase và exoglucanase hoạt động
của cellulose đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp thử màu, khi mạnh CMC còn
nguyên vẹn sẽ bắt màu với Cogo red tạo nên màu đỏ trong môi trƣờng bazo và
màu xanh trong môi trƣờng acid.
- Tiến hành:
+ Dùng môi trƣờng có chứa CMC đổ ra đĩa thạch và đục lỗ thạch với
đƣờng kính của các lỗ thạch là 8 mm.
+ Hút dịch enzyme lỏng vào các ống eppendorf ly tâm và tra vào lỗ thạch.
Giữ mẫu trong tủ lạnh 4oC 2 giờ cho enzyme khếch tán vào môi trƣờng
+ Tiếp theo ủ ở 30oC trong 24giờ. Sau 24 giờ nhuộm mẫu với thuốc thử
Cogo red 0,3% trong 10 phút sau đó rửa sạch với NaCl 1M.
Đo đƣờng kính vịng phân giải cellulose rồi xác định khả năng thủy phân
tinh bột theo cơng thức (D – d) mm
Trong đó:
D: đƣờng kính vịng phân giải cellulose (mm)
d: đƣờng kính lỗ thạch (d = 10 mm)

17


PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, làm thuần tạo bộ sƣu tập các chủng nấm mốc từ gỗ mục
Trong gỗ hàm lƣợng lignin chiếm khoảng 20% trọng lƣợng thân gỗ, đây
sản phẩm trao đổi chất trong thực vật bậc cao, đồng thời là chất kết dính trong
thân cây. Do đó các mẫu bị phân hủy bởi nấm rất có thể có những chủng nấm có
mặt hoặc tham gia vào q trình phân giải lignin sẽ có hoạt tính laccase. Vì thế
đề tài đƣợc chọn các mẫu gỗ mục từ rừng tại núi Luốt để phân lập các chủng
nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase.
Sau khi phân lập các mẫu nấm trên môi trƣờng PDA bổ sung kháng sinh.
Nấm phát triển sau 3 – 5 ngày. Dựa trên việc quan sát đặc điểm hình thái khuẩn
lạc và hệ sợi, các chủng nấm mốc đƣợc tập hợp thành bộ sƣu tập gồm 13 chủng
nấm ( kí hiệu CN1 – CN13).
Kết quả phân lập đƣợc thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hình thái khuẩn lạc một số chủng nấm mốc phân lập đƣợc
STT

1

Kí hiệu
chủng

Đặc điểm hệ sợi nấm

CN1

- Khuẩn lạc ban đầu có màu xanh non
viền trắng bao quanh sau chuyển sang

màu xanh lá.
- Khuẩn lạc có hệ sợi.
Kích thƣớc khuẩn lạc: 33 x 40 mm, có
các dạng hình khác nhau tùy vào điều
kiện ni cấy.

CN2

- Khuẩn lạc ban đầu có màu xám đen
viền trắng bao quanh sau chuyển sang
màu đen viền trắng.
- Khuẩn lạc có hệ sợi.
- Kích thƣớc khuẩn lạc: 31 x 32,5 mm
có dạng hình cầu.

2

18

Hình thái nấm


3

CN3

4

CN4

5

CN5

6

CN6

7

CN7

- Khuẩn lạc ban đầu có màu vàng viền
trắng bao quanh sau chuyển sang màu
cam viền trắng.
- Khuẩn lạc có hệ sợi.
- Kích thƣớc khuẩn lạc: 28 x 41 mm,
có các dạng hình khác nhau tùy vào
điều kiện ni cấy.
- Khuẩn lạc ban đầu có màu xám viền
trắng bao quanh sau chuyển sang màu
xanh dƣơng viền trắng.
- Có hệ sợi.
- Kích thƣớc khuẩn lạc: 28 x 30 mm
có dạng hình cầu.
- Khuẩn lạc có màu xanh non và viền
trắng bao quanh
- Khuẩn lạc có ó dạng bột.
- Kích thƣớc khuẩn lạc: 8 x 12 mm, có
các dạng hình khác nhau phụ thuộc vào

điều kiện ni cấy
- Khuẩn lạc có màu xanh dƣơng và
viền trắng bao quanh sau chuyển sang
màu xanh lục viền màu xanh lá nhạt,
- Khuẩn lạc có dạng bột.
- Khuẩn lạc phát triển xung quanh đĩa.
- Khuẩn lạc có màu xanh dƣơng và
viền trắng bao quanh sau chuyển sang
xanh đen.
- Khuẩn lạc có dạng bột.
- Khuẩn lạc phát triển xung quanh đĩa.

19