Phân lập và tạo dòng gen mã hóa chitinase từ vi khuẩn bacillus sp

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƢỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÕNG GEN MÃ HÓA CHITINASE
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP.

TRỊNH THỊ PHƢƠNG THẢO

Đà Nẵng, năm 2020

1


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA SINH MÔI TRƢỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TẠO DÕNG GEN MÃ HĨA CHITINASE
TỪ VI KHUẨN BACILLUS SP.

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2016 - 2020
Sinh viên: Trịnh Thị Phƣơng Thảo
Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Vũ Đức Hoàng

Đà Nẵng, năm 2020

2


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết
quả nghiên cứu của tôi và chưa từng được công bố trong các cơng trình nào khác trước
đây. Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa
học.

Sinh viên

Trịnh Thị Phƣơng Thảo

i


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến
ThS. Vũ Đức Hoàng và TS. Nguyễn Đức Huy đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và
tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện và hồn thành khóa luận.
Tơi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Mỹ Tiểu Ngọc và Kỹ sƣ Nguyễn Chính Thành
đã trực tiếp hƣớng dẫn cho tơi, tận tình giúp đỡ và truyền đạt kinh nghiệm tơi trong q
trình nghiên cứu.
Tơi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh – Môi trƣờng, Trƣờng Đại
học Sƣ phạm, Đại học Đà Nẵng đã giúp đỡ, hỗ trợ tạo mọi điều kiện tốt nhất để thực hiện
đề tài và đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tơi học tập trong 4 năm đại học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ động viên tôi
trong suốt thời gian làm khóa luận.
Tơi xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2020
Sinh viên

Trịnh Thị Phƣơng Thảo

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... ii
MỤC LỤC .......................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................... vii
TĨM TẮT........................................................................................................................... ix
MỞ DẦU ............................................................................................................................. 1
1.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................................. 1

2.

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI .................................................................................................. 2

3.

Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI ........................................................................................... 2

4.

3.1.

Ý nghĩa khoa học ................................................................................................. 2

3.2.

Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................. 2

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................... 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SP. ........................................................................... 3
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE ............................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu về chitinase ......................................................................................... 5
1.2.2. Phân loại chitinase ............................................................................................... 6
1.2.3. Cấu trúc của chitinase .......................................................................................... 8
1.2.4. Cơ chế thủy phân chitin ..................................................................................... 10
1.2.5. Nguồn thu nhận chitinase .................................................................................. 11
1.2.6. Ứng dụng của chitinase ..................................................................................... 12
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE ....................................................... 16
1.3.1. Một số nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................... 16
1.3.2. Một số nghiên cứu trên thế giới ......................................................................... 17
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 21
2.1. VẬT LIỆU ................................................................................................................ 21
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 21
2.2.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus sp. ........................................................................... 21
iii

2.2.2. Xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa ........................................ 22
2.2.3. Xác định hoạt tính chitinase của các chủng Bacillus sp..................................... 23
2.2.4. Tách chiết DNA tổng số ..................................................................................... 24
2.2.5. Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử .......................................... 24
2.2.6. Khuếch đại PCR gen mã hóa chitinase .............................................................. 25
2.2.7. Tạo dịng gen mã hóa chitinase vào vector pGEM®-T Easy .............................. 26
2.2.8. Giải trình tự gen mã hóa chitinase...................................................................... 26
2.2.9. Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................... 27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 28
3.1. PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SP. ................................................................ 28
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ VÀ SINH HÓA .................................... 30
3.3. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHITINASE TỪ CÁC CHỦNG BACILLUS SP. ........ 32
3.4. TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ ............................................................................. 34
3.5. ĐỊNH DANH VI KHUẨN BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ .............. 35
3.6. KHUẾCH ĐẠI PCR GEN MÃ HÓA CHITINASE ............................................... 35
3.7. TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA CHITINASE VÀO VECTOR pGEM®-T EASY .... 37
3.8. TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA CHITINASE .............................................................. 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 45
1.

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 45

2.

KIẾN NGHỊ............................................................................................................. 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 46
Tài liệu Tiếng Việt........................................................................................................... 46
Tài liệu Tiếng Anh ........................................................................................................... 47
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 55

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Bp

Base pair

Cs

cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

GH

glycosyl hydrolase

GlcNAc

N-acetyl-D-glucosamine

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB

Luria bertani (môi trƣờng Luria bertani)

MMHL

Minimal Medium recommended by Hsu and Lockwood

NCBI

National Center for Biotechnology Information (Trung
tâm thông tin công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ)

PCI

Phenol : chloroform : isoamylalcohol

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

TAE

Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA

X-gal

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-DGalactopyranoside

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Trình tự các mồi đƣợc dùng để khuếch đại gen 16S rRNA

25

2.2

Trình tự các mồi đƣợc dùng để khuếch đại gen chitinase

25

2.3

Trình tự các mồi đƣợc dùng để giải trình tự gen chitinase

27

3.1
3.2

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và Gram của
7 củng vi khuẩn
Khả năng sinh tổng hợp chitinase của 7 chủng Bacillus sp.

vi

29
33


DANH MỤC HÌNH
Hình
1.1

Tên hình
Cấu trúc mơ đun của họ glycol hydrolase 18 của các vi khuẩn
khác nhau và cấu trúc ba chiều của ChiA74 từ B. thuringiensis

Trang
9

1.2

Vị trí phân cắt chitin của chitinase

10

2.1

Vector pGEM®-T Easy

21

3.1

Hình thái khuẩn lạc của 7 chủng vi khuẩn

28

3.2

Hình thái tế bào của 7 chủng vi khuẩn sau khi nhuộm Gram

30

3.3
3.4
3.5

Hình ảnh thử hoạt tính sinh tổng hợp catalase của 7 chủng vi
khuẩn
Hình ảnh thể hiện khả năng di động của 7 chủng vi khuẩn

Hình ảnh thử hoạt tính sinh tổng hợp oxidase của 7 chủng vi
khuẩn

30
31
32

3.6

Vịng halo thể hiện hoạt tính chitinase của 7 chủng Bacillus sp

33

3.7

Hình ảnh điện di DNA tổng số của chủng TB1

34

3.8

Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại PCR trình tự 16S rRNA

35

3.9

3.10

3.11

3.12

3.13

3.14

Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại PCR gen mã hóa
chitinase
Hình ảnh điện di tinh sạch sản phẩm PCR gen chitinase
từ Bacillus sp. TB1
Thể biến nạp trên mơi trƣờng LB rắn có bổ sung ampicillin,
X-gal, IPTG
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR các khuẩn lạc màu trắng trên
đĩa mơi trƣờng chọn lọc.
Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy
/chitinase
Trình tự nucleotide gen mã hóa chitinase phân lập từ Bacillus
sp. TB1
vii

36

36

37

38

39

40


3.15
3.16
3.17

Trình tự amino acid suy diễn gen chitinase của chủng Bacillus
sp. TB1.
Cấu trúc 3 vùng của protein suy diễn từ gen mã hóa chitinase
Mơ hình cấu trúc khơng gian 3 chiều của chitinase từ chủng
Bacillus sp. TB1

41
41
42

Kết quả so sánh trình amino acid suy diễn gen mã hóa chitinase
3.18

của chủng Bacillus sp. TB1 với B. subtilis HDZK-BYSB7, B.
cereus SV1, B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1

viii

43


TĨM TẮT

Chitinase (EC 3.2.1.14) là enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân
liên kết 1,4- β-(1,4)-glycosyl của chitin tạo thành các đơn phân N-acetyl D-glucosamine
và các chitosan oligomer. Chitinase đƣợc phát hiện ở nhiều sinh vật khác nhau nhƣ ở thực
vật, động vật, côn trùng, nấm và vi khuẩn. Chitinase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong một số
lĩnh vực nhƣ: sản xuất chito-oligosaccharide, làm đối kháng sinh học trong liệu pháp chữa
bệnh nấm cây trồng, xử lý nguồn phế liệu chitin của các loài giáp xác trong chế biến thủy
sản,…. Tiềm năng ứng dụng của chitinase là rất lớn nên cần có phƣơng pháp thích hợp để
sản xuất chúng ở quy mơ cơng nghiệp. Trong đó, cơng nghệ DNA tái tổ hợp với việc tạo
dịng các gen mã hóa chitinase từ Bacillus sp. là bƣớc đầu nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu
để sản xuất một lƣợng lớn chitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao.
Từ mẫu nƣớc thải thủy sản và nƣớc thải hồ nuôi tôm đã phân lập đƣợc 7 chủng
Bacillus. Trong đó có 4 chủng sản xuất chitinase là TB1, TB3, HV1 và HV2 với đƣờng
kính vịng phân giải theo tuần tự là 13 mm, 4 mm, 3 mm và 4 mm. Kết quả định danh
phân từ chủng TB1 bằng giải trình tự 16S rRNA chứng minh chủng TB1 thuộc chi
Bacillus và đƣợc đặt tên là Bacillus sp. TB1, trình tự 16S rRNA của chủng Bacillus sp.
TB1 đƣợc đăng ký trên ngân hàng GenBank với mã số MT750324.
Gen mã hóa chitinase đã đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số chủng Bacillus sp. TB1
và tạo dịng thành cơng vào vector pGEM®-T Easy. Kết quả giải trình tự gen mã hóa
chitinase từ chủng Bacillus sp. TB1 cho thấy gen có chiều dài 2025 nucleotide và đƣợc
đăng ký trên ngân hàng GenBank với các mã số MT633090. Phân tích trình tự gen
chitinase của chủng Bacillus sp. TB1 mã hóa cho một protein gồm 674 amino acid với
trọng lƣợng phân tử khoảng 74 kDa trong đó 32 amino acid đầu N là peptide tín hiệu.
Phân tích cấu trúc dự đốn của protein suy diễn từ gen mã hóa chitinase từ chủng Bacillus
sp. TB1 cho thấy chitinase thuộc nhóm glycosyl hydrolase 18. Cấu trúc protein gồm 3
vùng: vùng hoạt động (vùng thủy phân) ở đầu N, tiếp theo là vùng Fibronectin (FnIII),
cuối cùng là vùng gắn kết chitin (Chitin Binding Domain: CBD) ở đầu C. Cấu trúc bậc 2
dựa đoán của chitinase có 15 vị trí gập cuộn xoắn α và 23 vị trí gập cuộn phiến β.
ix

MỞ DẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Chitin là polymer sinh học, rất phổ biến và phân bố rộng rãi trong tự nhiên chỉ sau
cellulose. Chitin đƣợc cấu thành từ các đơn vị N-acetyl D-glucosamin (GlcNAc) thông qua
liên kết β-(1,4)-glycosyl (Muzzarelli, 2013). Chitin tồn tại tự nhiên dƣới dạng
polysaccharide cấu trúc của các sinh vật nhƣ: thành tế bào của nấm, khung vỏ ngoài của
động vật chân đốt và vỏ ngoài của các loài giáp xác,…. Sử dụng chitinase là một trong
những phƣơng pháp chuyển hóa chitin tạo các dẫn xuất mạch ngắn chitooligosaccharide có
giá trị kinh tế và ứng dụng cao, an tồn với con ngƣời và mơi trƣờng.
Chitinase

(EC

3.2.1.14)

hay

cịn

gọi

poly-(1,4-N-acetyl-β-glucosaminide)

glucanhydrolase là enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân liên kết β(1,4)-glycosyl của chitin tạo thành các đơn phân N-acetyl D-glucosamine và các chitosan
oligomer. Chitinase đƣợc phát hiện ở nhiều sinh vật khác nhau nhƣ ở thực vật, động vật, côn
trùng, nấm và vi khuẩn (Hamid và cs, 2013). Chitinase có nguồn gốc từ các chủng vi khuẩn
khác nhau nhƣ Salinivibrio sp. (Le và cs, 2018), Vibrio sp. (Jahromi và cs, 2018), Bacillus
sp. (Pan và cs, 2019), Paenibacillus sp. (Kusaoke và cs, 2017)…. đã đƣợc nghiên cứu và sử
dụng rộng rãi. Vi khuẩn sản xuất chitinase đã đƣợc phân lập từ đất, nƣớc thải nuôi tôm, phân
rác thải trong vƣờn, cơng viên và suối nƣớc nóng (Yuli và cs, 2004).

Chitinase đƣợc ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực nhƣ: sản xuất chitooligosaccharide, sản xuất protein đơn bào (Nasseri và cs, 2011), làm chất ức chế, làm đối
kháng sinh học trong liệu pháp chữa bệnh nấm cây trồng, thuốc trừ sâu sinh học (Singh và
cs, 2014; Castillo và cs, 2016), xử lý nguồn phế liệu chitin của các loài giáp xác trong chế
biến thủy sản (Swiontek và cs, 2014).
Tiềm năng ứng dụng của chitinase là rất lớn. Do đó, cần có phƣơng pháp thích hợp để
sản xuất chúng ở quy mô công nghiệp. Khả năng sản xuất chitinase nhanh chóng của vi sinh
vật cho tiềm năng ứng dụng chitinase trên quy mơ lớn; tuy nhiên, vẫn cịn một số khía cạnh
hạn chế khi sản xuất chitinase, bao gồm các nghiên cứu tối ƣu sản xuất trên quy mô cơng
nghiệp, quy trình tinh chế enzyme thơ năng suất cịn thấp và hoạt độ của enzyme thấp. Các
1


nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để tạo điều kiện cải thiện sản xuất chitinase. Trong đó, cơng
nghệ DNA tái tổ hợp với việc chọn lọc các gen mã hóa chitinase từ Bacillus sp. để tạo dịng
và biểu hiện trong các vật chủ thích hợp nhằm tạo ra một lƣợng lớn chitinase tái tổ hợp có
hoạt tính cao đƣợc coi là phƣơng thức có triển vọng và khả thi nhất.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tạo dịng gen
mã hóa chitinase từ vi khuẩn Bacillus sp.”

2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Phân lập đƣợc vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và tạo
dịng thành cơng gen mã hóa chitinase từ chủng Bacillus sp. đã phân lập.

3. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp những dẫn liệu khoa học về quy trình tạo dịng gen mã hóa chitinase từ vi
khuẩn Bacillus sp., góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về tạo dòng gen mã hóa
chitinase.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu là cơ sở để tạo nguồn nguyên liệu di truyền cho những nghiên cứu
tiếp theo sâu hơn về biểu hiện gen chitinase và nghiên cứu ứng dụng sản xuất chitinase quy
mô công nghiệp sau này.

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có trong nƣớc thải thủy sản và nƣớc thải hồ
nuôi tôm.
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao
và định danh phân tử.
Tạo dịng gen mã hóa chitinase vào hệ thống vector pGEM®-T Easy và xác định trình
tự gen mã hóa chitinase.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SP.
Phân loại theo khóa phân loại của Bergey (Buchanon và cs, 1989):
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Năm 1835, vi khuẩn này đƣợc tìm ra và đặt tên là Vibrio subtilis bởi Christian
Gottfried Ehrenberg. Đến năm 1872 đƣợc Ferdinand Cohn đổi thành Bacillus subtilis.
Bacillus sp. là vi khuẩn Gram dƣơng, có hình que đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc
thành sợi, chiều dài của chúng có thể khác nhau tùy vào điều kiện hóa lý trong q trình phát
triển, trong khi chiều rộng chiều rộng tế bào có nét đặc trƣng hơn. Mức độ khác nhau tùy
thuộc vào nguồn carbohydrate trong môi trƣờng nuôi cấy. Khi phát triển trên mơi trƣờng

nutrient agar chỉ một vài lồi Bacillus nhƣ B. cereus, B. anthracis , B. mycoides và B.
megaterium có chiều rộng tế bào lớn hơn 1 µm. Bacillus sp. sinh trƣởng trong điều kiện hiếu
khí hoặc kị khí khơng bắt buộc. Bacillus sp. có khả năng sinh bào tử, bào tử đƣợc hình thành
khi gặp các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng nhƣ nhiệt độ quá cao, thiếu hụt chất dinh dƣỡng
và có thể tồn tại trong trạng thái không hoạt động này trong nhiều năm, khi gặp điều kiện
thuận lợi bào tử sẽ nảy mần và hình thành nên tế bào vi khuẩn mới.
Hình thái khuẩn lạc tùy thuộc rất lớn vào điều kiện nuôi cấy nhƣ thành phần mơi
trƣờng, độ ẩm, nhiệt độ. Ở một vài lồi có hiện tƣợng tạo khuẩn lạc thơ ráp, lởm chởm, tạo
vảy hay màng mỏng trong môi trƣờng nuôi cấy. Trong khi đó một số khác lại trơn nhẵn
(Buchanon và cs, 1989).
Các lồi thuộc chi Bacillus là có khả năng dị dƣỡng nhiều loại hợp chất hữu cơ đơn
giản (đƣờng, amino acid, acid hữu cơ). Trong một số trƣờng hợp, Bacillus cũng lên men
carbohydrate thƣờng tạo ra glycerol và butanediol. Một vài loài, chẳng hạn nhƣ B.
3


megaterium, không yêu cầu các yếu tố dinh dƣỡng tăng trƣởng hữu cơ; những lồi khác có
thể cần amino acid, vitamin B hoặc cả hai. Phần lớn các loài trong chi Bacillus sinh trƣởng
với nhiệt độ tối ƣu trong khoảng từ 30 đến 45oC, nhƣng một số là loại ƣa nhiệt có độ tối ƣu
cao tới 65oC. Những lồi đặc biệt có khả năng phát triển và sinh bào tử ở 0 oC. Chúng đƣợc
tìm thấy phát triển trong phạm vi pH từ 2 đến 11. Trong phịng thí nghiệm, trong điều kiện
tăng trƣởng tối ƣu, các loài Bacillus thể hiện thời gian tạo ra tế bào mới khoảng 25 phút
(Rosovitz và cs, 1998).
Dựa vào sự đa dạng trong trao đổi chất và khả năng hình thành bào tử mà vi khuẩn
Bacillus sp. có thể tồn tại và tạo thành những quần thể trong các điều kiện khác nhau và rất
phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập vi khuẩn Bacillus từ những nguồn khác nhau nhƣ
đất, nƣớc, thực phẩm,…Trong tự nhiên, hầu hết các lồi Bacillus khơng có khả năng gây
bệnh trên ngƣời và động vật khác, trừ B. anthracis gây bệnh than và B. cereus gây ngộ độc
thực phẩm. Một vài loài là vi khuẩn gây bệnh hay ký sinh trên động vật nhƣ B. thuringiensis
ký sinh trên cơn trùng.

Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào: amylase, protease,
cellulose, lipase, chitinase….vì vậy chúng rất có tiền năng ứng dụng rất lớn trong cơng
nghiệp, xử lý môi trƣờng,….
Nhiều chủng Bacillus đã đƣợc khai thác mạnh mẽ để lên men sản xuất các enzyme
công nghiệp, vitamin, kháng sinh và các sản phẩm giá trị khác. Lên men sử dụng các chủng
Bacillus, chẳng hạn nhƣ B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus chiếm ƣu thế trong sản
xuất protease chất tẩy rửa công nghiệp. Một trong những lợi thế của enzyme đƣợc sản xuất
từ Bacillus là khả năng chịu nhiệt của nó ở nhiệt độ làm việc cao. Ví dụ, protease kiềm do B.
clausii tạo ra có nhiệt độ tối ƣu khoảng 60°C, trong khi một α-amylase đƣợc tổng hợp từ B.
licheniformis hoạt động ở 90°C và chịu đƣợc tới 110°C, chitinase đƣợc tạo ra bởi B. subtilis
SL13 có nhiệt độ hoạt động tối ƣu ở 55oC, chitinase từ vi khuẩn B. thuringiensis HBK-51
hoạt động tốt nhất ở 110ºC và đƣợc coi là một loại enzyme chịu nhiệt (Kuzu và cs, 2012).
Biến đổi gen cho phép các chủng Bacillus tái tổ hợp có khả năng biểu hiện tối ƣu các
enzyme quan tâm và do đó cải thiện khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và
protein dị loại (Du và cs, 2011).
4


1.2. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE
1.2.1. Giới thiệu về chitinase
Chitinase

(EC

3.2.1.14)

hay còn

gọi

(poly (1,4-N-acetyl-β-glucosaminide)

glucanhydrolase) là enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase là enzyme xúc tác q trình
thủy phân chitin khơng hịa tan trong nƣớc thành các sản phẩm chitooligosaccharide hịa tan
trong nƣớc thơng qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)-glycosyl tạo thành các đơn phân
N-acetyl D-glucosamine, chitobiose hay chitibiose hay chitotriose, có kích thƣớc từ 20 kDa
đến 90 kDa (Bhattachrya và cs, 2007). Chitinase hiện diện trong nhiều sinh vật nhƣ vi
khuẩn, nấm, côn trùng, thực vật và động vật (Hamid và cs, 2013); vai trò của chúng trong
những sinh vật này cũng rất đa dạng: là một phần trong hệ tiêu hóa của động vật không
xƣơng sống, phân hủy một phần vỏ cutin trong các lồi cơn trùng và giáp xác; ở thực vật và
động vật, giúp thực vật kháng lại các loại nấm gây bệnh là một phần trong các tác nhân gây
bệnh của virus, giúp nấm phân hủy và thu nhận cơ chất...(Duo-Chuan, 2006). Ở vi khuẩn,
chitinase có vai trị trong việc thủy phân chitin làm nguồn carbon và năng lƣợng cho cơ thể
cũng nhƣ tái sản xuất chitin trong tự nhiên (Itoh và cs, 2019).
Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của chitin. Chitin là polyme sinh học
không phân nhánh, cấu thành từ các đơn vị N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc) thông qua
liên kết β-(1-4)-glycosyl. Chitin là một trong các polymer sinh học phổ biến nhất trong tự
nhiên chỉ đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose) (Shahidi
và cs, 2005).
Trong tự nhiên, chitin gồm 3 dạng cấu trúc là α, β và γ-chitin. Ở dạng α-chitin, các
chuỗi polysaccharide xuôi và ngƣợc đƣợc xếp xen kẽ nhau, việc sắp xếp này làm cho liên
kết hydro trở lên mạnh mẽ hơn, do đó làm cho nó ổn định hơn. Đây là dạng phổ biến nhất
trong tự nhiên. Dạng α-chitin là thành phần cấu tạo nên bộ xƣơng ngồi của cơn trùng, giáp
xác, nhuyễn thể và vách tế bào của nấm. Dạng β-chitin thƣờng hiếm hơn, có cấu trúc song
song gồm các chuỗi polysaccharide xếp cùng hƣớng, xen kẽ nhau và tồn tại ở dạng liên kết
với protein. Loại β thu đƣợc chủ yếu từ động vật thân mềm nhƣ mực. Trong khi đó loại γchitin đƣợc hình thành từ hỗn hợp hai loại α-chitin và β-chitin, cụ thể là 2 chuỗi xuôi xen kẽ
với 2 chuỗi ngƣợc. Chitin là thành phần chính trong bộ xƣơng ngoài của một số loài động
5

vật không xƣơng sống (giáp xác, côn trùng, nhện) và thành tế bào của hầu hết vi nấm và tảo,
ngoài ra chitin cịn có trong một số lồi vi sinh vật biển.
Nguồn chitin nhiều nhất là từ các loài sinh vật có vỏ (tơm, cua, nhuyễn thể), mực, hàu.
Hàng năm, có khoảng 29,9; 1,4 và 0,7 triệu tấn chitin thu đƣợc từ các lồi động vật có vỏ,
hàu và mực ống (Narayanan và cs, 2014). Riêng ngành khai thác tôm thẻ chân trắng hàng
năm đã thải ra khoảng 3,14 triệu tấn vỏ (trọng lƣợng khơ) trên tồn cầu (Hongkulsup và cs,
2016), trong đó lƣợng chitin chiếm 27%.
Một trong những phƣơng pháp chuyển hóa chitin tạo các dẫn xuất mạch ngắn chitinoligosaccharide có giá trị kinh tế và ứng dụng cao, an tồn đối với con ngƣời và mơi trƣờng
là sử dụng chitinase. Các enzyme này có giá trị ứng dụng khơng chỉ để sản xuất các dẫn xuất
enzyme hữu ích mà cịn là tác nhân kiểm sốt nấm gây bệnh (Barboza-Corona và cs, 2008).

1.2.2. Phân loại chitinase
Theo danh pháp quốc tế, Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử
quốc tế xếp chitinase vào phân lớp 3 - các enzym xúc tác phản ứng thủy phân (hydrolase), tổ
2 - thủy phân các liên kết glycoside (glycosidase), nhóm 1 (thủy phân liên kết O- và Sglycoside) (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992).

a. Phân loại theo trình tự amino acid
Chitinase có thể đƣợc xếp thành các nhóm khác nhau tùy theo quan điểm của từng tác
giả. Dựa vào trình tự amino acid đầu nitơ, sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide
nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại chitinase thành 5 nhóm:
Nhóm I: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm
xúc tác thơng qua một đoạn giàu glycine hoặc proline ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận
biết). Vùng giàu cystein có vai trị quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin
nhƣng khơng cần cho hoạt động xúc tác.
Nhóm II: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn
giàu cystein ở đầu N và peptide nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tƣơng tự chitinase
ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn; chúng đƣợc cảm ứng bởi các
tác nhân bên ngồi.
Nhóm III: Trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhóm I và II.
6

Nhóm IV: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 - 47% trình
tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn
giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I.
Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng
giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong q trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.

b. Phân loại dựa vào cấu trúc phân tử
Chitinase đƣợc phân loại trong cơ sở dữ liệu CAZY (Carbohydrate Active Enzymes)
(Lombard và cs, 2014) dựa trên trình tự acid amin và cấu trúc phân tử thành các họ glycosyl
hydrolase (GH) 18, 19 và 20.Chúng khác nhau rõ rệt về trình tự amino acid và tính chất xúc
tác. Tất cả họ glycosyl hydrolase 18 đƣợc đặc trƣng bởi một vùng xúc tác bao gồm một
domain triosephosphate isomerase (TIM) barrel (β/α)8và và xúc tác phản ứng thủy phân theo
cơ chế hỗ trợ cơ chất (Umemoto và cs, 2015), trong khi miền xúc tác của họ 19 là miền
giống lysozyme giàu α-helix đặc trƣng bởi khe hở sâu và áp dụng cơ chế xúc tác dịch
chuyển đơn (Kezuka và cs, 2006).
Họ glycol hydrolase 18: Là họ chitinase lớn nhất ở vi khuẩn, nấm và côn trùng, đƣợc
phân thành ba phân nhóm (A, B, C), dựa trên sự tƣơng tự trình tự amino acid. Chitinase từ
phân họ A có cấu trúc mơ đun bao gồm miền xúc tác (CD), miền Fibronectin III (FnIII) và
miền liên kết chitin (CBD). Một trong những khác biệt về cấu trúc chính giữa ba phân họ là
phân họ A có miền α + β nhỏ (miền chèn chitinase, CID) đƣợc chèn vào miền xúc tác TIM,
khơng có trong phân họ B. Ngoài ra, liên kết cơ chất khe hở của chitinase từ phân họ A sâu
hơn so với quan sát thấy trong phân nhóm B và C. Mặc dù vai trị của CID chƣa đƣợc hiểu
rõ, nhƣng dƣờng nhƣ việc đƣa nó vào miền TIM tạo điều kiện thuận lợi cho sự định hƣớng
và liên kết mạnh mẽ của enzyme với cơ chất (Juárez-Hernández và cs, 2019).
Họ glycol hydrolase 19: Thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ: cà chua (Solanum
tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu hà lan (Pisum sativum),... ngoài ra cịn có ở xạ
khuẩn Str. griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae…(Kezuka và cs, 2006; Han và cs,
2016).

Họ glycol hydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetyl hexosaminidase có
nguồn gốc từ vi khuẩn và ngƣời.
7


c. Phân loại theo phản ứng cắt chitin
Dựa vào phản ứng phân cắt chitin, chitinase đƣợc phân thành 2 dạng: dạng 1 là
endochitinase (EC.3.2.1.14), dạng 2 là exochitinase gồm 2 loại là chitobiosidase
(EC.3.2.1.29) và N-acetyl β-glucosaminidase (EC.3.2.1.30).
Endochitinase phân cắt bên trong phân tử chitin và chitodextrin tạo ra các phân tử có
khối lƣợng thấp nhƣ chitotriose, chitotetraose và diacetyl chitobiose.
Chitobiosidase xúc tác quá trình phân cắt các vi sợi chitin ở đầu khơng khử, giải phóng
ra các diacetyl chitobiose.
N-acetyl β-glucosaminidase phân cắt các oligomer (sản phẩm của sự thủy phân bởi
endochitinase và chitobiosidase) để tạo ra các đơn phân N-acetyl D-glucosamine.
1.2.3. Cấu trúc của chitinase

a. Cấu trúc phân tử
Các chitinase có nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau. Sự
khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối lƣợng phân tử, thành phần và trật tự
sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Ở loài thân mềm, chân đốt, động vật có
xƣơng (cá, lƣỡng cƣ, thú) chitinase có trọng lƣợng phân tử cao vào khoảng 90 - 120 kDa.
Chitinase của thực vật có trọng lƣợng phân tử từ 25 - 40 kDa. Trọng lƣợng phân tử của
chitinase từ vi khuẩn là 20 - 80 kDa. Tuy nhiên, chitinase từ các lồi vi khuẩn khác nhau có
khối lƣợng phân tử khác nhau. Chitinase từ B. thuringiensis var. kurstaki HD73 có khối
lƣợng 74 kDa, mã hóa 676 amino acid. Chitinase này thuộc nhóm I, họ glycosyl hydrolase
18, điểm đẳng điện pI là 5,75 (Barboza-Corona và cs, 2008). Chitinase từ chủng B. cereus
VITSD3 có khối lƣợng 55 kDa (Devi và cs, 2015). Ở nấm, chitinase từ chủng Trichoderma
viride N9 có khối lƣợng phân tử 46 kDa mã hóa bởi 420 amino acid (Jenifer và cs, 2014).
Chitinase của xạ khuẩn nội sinh Streptomyces hygroscopicus lại có khối lƣợng phân tử trong

khoảng 76, 78 và 80,8 kDa (Haggag và cs, 2012).

b. Cấu trúc không gian
Chitinase vi khuẩn là một tổ chức mơ-đun, trong đó miền xúc tác (CD) có thể đƣợc liên
kết với các miền sau: miền chèn chitin (CID), miền Fibronectin III (FnIII) và miền liên kết
chitin (CBD). Tổ chức mơ-đun có thể khác nhau ở các vi khuẩn khác nhau (Sheila và cs,
8


2020). Mơ hình cấu trúc mơ-đun của chitinase họ glycol hydrolase 18 đƣợc trình bày ở Hình
1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc mô đun của họ glycol hydrolase 18 của các vi khuẩn khác nhau và
cấu trúc ba chiều của ChiA74 từ B. thuringiensis. (I) Liên kết mô đun giữa các chitinase vi
khuẩn khác nhau. Sp: Peptide tín hiệu; GH18: miền xúc tác; CID: miền chèn chitinase;
CBM: miền liên kết chitin; FnIII: miền fibronectin loại III, Chitinase (Chi) của: Bt: B.
thuringiensis (mã số: AF424979.1); Bl: B. licheniformis ( mã số: QAS14701.1); Sp: Serratia
proteamaculans (mã số: AGF70636.1); Sm: S. marcescens (mã số: ABI79318.1); Sm: S.
marcescens (mã số: AHH32576.1); Bc: B. cereus ( mã số: AFQ09088.1); Cm:
Chitinolyticbacter meiyuanensis (mã số: ATN39892.1); Ah: Aeromonas hydrophila (mã số:
AAG09437.1); Tk: Thermococcus kodakarensis (mã số: BAA88380). (II) Cấu trúc tinh thể
của chitinase ChiA74 của B. thuringiensis (Sheila và cs, 2020).
Miền thủy phân (GH18): Các miền xúc tác GH18 chitinase có nếp gấp (β / α)8 TIM với
dƣ lƣợng xúc tác quan trọng đƣợc đặt trên sợi β số 4. Miền xúc tác bao gồm khe hở liên kết
cơ chất sâu trên đỉnh cấu trúc (β / α)8 (Vaaje-Kolstad và cs, 2013). Miền chèn chitin (CID)
chỉ có ở phân họ A của họ GH 18, bao gồm năm hoặc sáu sợi β và một sợi α chèn vào giữa
chuỗi xoắn α thứ bảy và chuỗi β thứ bảy của vùng TIM. CID tạo thành một bức tƣờng dọc
theo khe hở liên kết cơ chất với vùng TIM của chitinase làm tăng độ sâu của khe hở giúp
liên kết tốt hơn với cơ chất (Srivastava và cs, 2006).
9

Miền liên kết chitin (CBD): Chức năng miền liên kết chitin là để tạo điều kiện cho việc
định vị chính xác miền xúc tác và cho quá trình kết tinh cục bộ của cơ chất. Một số nghiên
cứu đã xác nhận rằng sự hiện diện của các miền này làm tăng ái lực cơ chất cũng nhƣ hiệu
quả của quá trình thủy phân chitin, đặc biệt đối với chitin tinh thể hơn (Li và cs, 2010).
Miền fibronectin III (FnIII): Miền này dƣờng nhƣ không liên quan trực tiếp đến liên
kết chitin. Tuy nhiên, các miền FnIII rất quan trọng đối với hoạt động của enzyme, có thể
bằng cách ảnh hƣởng đến cấu trúc enzyme tổng thể và sự định vị không gian của miền xúc
tác và miền liên kết chitin (Li và cs, 2010).

1.2.4. Cơ chế thủy phân chitin
Chitinase là các enzyme glycosyl hydrolase có thể phá vỡ polymer chitin bằng cách
thủy phân các liên kết β-(1,4)-glycosyl ngẫu nhiên thành các thành phần oligo và mono. Tùy
theo dạng phân loại enzyme là dạng endochitinase hay exochitinase (chitobiosidase và Nacetyl β-glucosaminidase) mà có cơ chế phân cắt khác nhau (Rathore và cs, 2015) (Hình
1.2).

Hình 1.2. Vị trí phân cắt chitin của chitinase (Rathore và cs, 2015)
Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitodextrin, sản phẩm
tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lƣợng phân tử khác nhau nhƣ chitotriose,
chitotetraose, nhƣng chiếm đa số là các diacetylchitobiose.

10


Chitobiosidase phân cắt chitin ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 (GlcNAc)n với n ≥
3 từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2.
N-acetyl β-glucosaminidase phân cắt các chitooligomer (sản phẩm của sự thủy phân
bởi endochitinase và chitobiosidase) hay chitin một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ
phóng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) (Thomas và cs, 2000).

Endochitinase, chitobiosidase và N-acetyl β-glucosaminidase có thể hoạt động trên cơ
chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên
chitin thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp
cho endochitinase hơn là chitobiosidase và N-acetyl β-glucosaminidase. Chitooligomer
(GlcNAc) và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhƣng Nacetyl β-glucosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù
chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của N-acetyl β-glucosaminidase nhƣng khơng là cơ chất
của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính
giữa endochitinase, chitobiosidase và N-acetyl β-glucosaminidase. Sản phẩm sau cùng của
sự phân cắt là N-acetyl D- glucosamine (Ðinh Minh Hiệp, 2007).

1.2.5. Nguồn thu nhận chitinase
Chitinase đƣợc tạo ra từ nhiều sinh vật, từ những lồi có thành phần cấu trúc là chitin
nhƣ nấm, cơn trùng, giáp xác, đến những lồi khơng có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật...Trong
đó, vi sinh vật đƣợc xem là nguồn cung cấp chitinase nhiều hơn so với động vật và thực vật.
Các sinh vật khác tổng hợp chitinase với các mục đích khác nhau. Vi khuẩn tổng hợp
chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn carbon. Ở thực vật và động vật, chitinase nằm
trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa
chitin của nấm. Đối với các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm hay côn trùng chứa chitin, phản ứng
tự vệ chính của thực vật là tạo ra chitinase. Chitinase đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn nhƣ
Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở
nhóm Streptomycetes (Itoh và cs, 2019).
Chitinase cũng đƣợc tạo ra bởi các loài nấm sợi thuộc các chi Trichoderma,
Aspergillus, Gliocladium, Calvatia,... và cả ở các nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus,...

11


Chitinase đƣợc thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm kí sinh gây bệnh
cho cây trồng. Những thực vật bậc cao có khả năng tạo chitinase nhƣ thuốc lá (Nicotiana
sp.), cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) ... và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn

cung cấp chitinase (Harman, 2000).
Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của
nhiều lồi động vật khơng xƣơng nhƣ ruột khoang, giun trịn, thân mềm, chân đốt... có thể
thu nhận đƣợc enzyme chitinase. Ðối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ
tuyến tụy và dịch dạ dày của các lồi cá, lƣỡng cƣ, bị sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của
những loài chim (Bussink và cs, 2006).
Ngồi ra, chitinase cịn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun trịn trong suốt q trình
phát triển và dịch tiết biểu bì của các lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Chitinase
giúp cơn trùng tiêu hóa màng ngồi của chúng trong q trình biến thái hay lột xác
(Shubakov và cs, 2004).
Tuy nhiên, hoạt tính của chitinase thu từ thực vật, động vật cịn chƣa cao, vì vậy việc
thu nhận chitinase chủ yếu vẫn từ vi sinh vật.

1.2.6. Ứng dụng của chitinase
a. Trong lĩnh vực y dược
Hiện nay, hoạt tính sinh học của các chitooligosaccharides ngày càng đƣợc nghiên cứu
sâu. Ngƣời ta sử dụng chitohexaose và chitoheptaose làm tác nhân kháng ung thƣ. Chitinase
thu nhận ở Vibrio alginolyticus phân cắt chitin thành chitopentaose và chitotriose. N, N'diacetylchitobioase đƣợc sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi đầu cho việc sinh tổng hợp
các chất có hoạt tính sinh học. Điều chế glucosamin từ chitin làm thuốc chống đau xƣơng
khớp là một vấn đề có ý nghĩa quan trọng trong y dƣợc (Trần Đình Toại và cs, 2008).
Hiện nay, bệnh truyền nhiễm gây ra do vi nấm là vấn đề chính đối với các bệnh nhân
suy giảm miễn dịch nhƣ bệnh nhân AIDS. Ngƣời ta ƣớc tính rằng 58 - 81% của tất cả các
bệnh nhân AIDS bị nhiễm các bệnh truyền nhiễm do vi nấm gây ra trong giai đoạn trƣớc
hoặc sau khi phát triển thành AIDS và có 10-20% bệnh nhân AIDS chết mà nguyên nhân
trực tiếp từ các bệnh truyền nhiễm do vi nấm. Các loại vi nấm chính liên quan đến bệnh cơ
hội ở các bệnh nhân AIDS là: Candida, Cryptococcosis, Histoplasmosis và
12


Coccidioidomycosis.

Nguồn

kháng

ngun

của

nấm

(mannan

của

Candidosis,

glucuronoxylomanan có trong nấm men) có hoạt tính nhƣ là một nhân tố ngăn chặn tế bào
lympho T trong sự phát triển của AIDS. Các nhà khoa học đã đề nghị một phƣơng pháp chẩn
đoán hiện đại các bệnh truyền nhiễm vi nấm bằng cách sử dụng chitinase đã đƣợc phân lập
từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1) nó kết hợp chặt chẽ với chition và có
thể sử dụng nhƣ một mẫu dị trong việc chuẩn đốn với độ nhạy cao để nhận diễn một cách
đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mô bệnh.
Chitinase chống lại ký sinh trùng gây bệnh nhƣ nấm Candida albicans gây bệnh ở ruột, âm
đạo, hoặc ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum gây bệnh sốt rét, giảm hoạt tính của
virus nucleopolyhedro Autographa californi (Thomas và cs, 2000; Barboza-Corona và cs,
2003).
Ngồi ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bơi ngồi
da chứa chất chống nấm bệnh thƣờng xảy ra ở các nƣớc vùng nhiệt đới bởi khả năng phân
hủy vách tế bào vi nấm của chúng.

b. Kiểm soát nấm bệnh
Kiểm soát sinh học sử dụng vi sinh vật là giải pháp đầy hứa hẹn sở hữu những lợi thế
nhƣ tính khả thi và tính hiệu quả về chi phí (Sharma và cs, 2009). Một số vi sinh vật tạo ra
các loại thuốc chống nấm có triển vọng chống lại các mầm bệnh chính sau thu hoạch
(Castillo và cs, 2016; Le và cs, 2018). Vi khuẩn sản xuất enzyme xúc tác thủy phân, nhƣ các
tác nhân sinh học tiềm năng của phytopathogens, bị phá vỡ cấu trúc thành tế bào. Điều trị
bằng chitinase có thể làm tăng thời gian bảo quản thực phẩm, có thể bằng cách làm hỏng
thành tế bào, ngăn ngừa sự nảy mầm của bào tử và cuối cùng làm giảm sự hƣ hỏng của thực
phẩm.
Hoạt tính kháng nấm của chitinase đã đƣợc quan sát thấy ở cả vi khuẩn và nấm. Ví dụ,
nghiên cứu của Le và Yang (2018) đã chứng minh rằng ChiC chitinase từ Salinivibrio cho
thấy hoạt động chống nấm chống lại nấm gây bệnh Fusarium oxysporum và Rhizoctonia
solani (Le và cs, 2018). Trong một nghiên cứu khác, Deng và cs (2019) đã chứng minh rằng
chitinase từ Trichoderma harzianum hoàn toàn ức chế sự phát triển của nấm phytopathogen
Botrytis cinerea với liều từ 1,5 đến 6,0 μg/mL (Deng và cs, 2019). Theo Liu và cộng sự
13


(2019), sự kết hợp của hai chitinase (chi60 và chi70) trong Xenorhabdus nematophilus đã ức
chế sự nảy mầm của bào tử bởi Verticillium dahliae và Coniella Diplodiella (Liu và cs,
2019). Dựa trên những nghiên cứu này, rõ ràng chitinase có giá trị nhƣ một nguồn chất
chống nấm mới có ứng dụng tiềm năng trong ngành công nghiệp thực phẩm để lƣu trữ trái
cây và rau quả.

c. Thuốc trừ sâu sinh học
Sử dụng thuốc diệt côn trùng, diệt nấm không chỉ gây tốn kém, bất tiện, nguy hiểm cho
tất cả các sinh vật và là một mối đe dọa đối với môi trƣờng. Với sự hiểu biết phong phú về
nấm bệnh và kiểm sốt mơi trƣờng mà các nhà nghiên cứu tạo ra các phƣơng pháp sinh học
có khả năng khám nấm và tiêu diệt côn trùng cho hiệu quả và an tồn. Chitinase có thể đƣợc

thêm vào nhƣ là một chất bổ sung của các thuốc diệt nấm và thuốc trừ sâu thƣờng đƣợc sử
dụng, khơng chỉ làm cho nó mạnh hơn mà còn giảm thiểu nồng độ của các chất hóa học tổng
hợp và tăng hoạt chất của thuốc diệt nấm và thuốc trừ sâu, ngồi ra nó khơng gây hại cho
môi trƣờng và sức khỏe của con ngƣời. Hoondal (1998) đã nghiên cứu khả năng tƣơng thích
của chitinase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus sp. BG-11 với các thuốc diệt nấm và thuốc trừ
sâu thƣờng đƣợc sử dụng.
Karasuda và cs (2003) đã nghiên cứu và nhận thấy một loại chitinase thực vật có thể
đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân kiểm sốt sinh học thay vì thuốc diệt nấm hóa học. Chitinase
E có nguồn gốc từ khoai mỡ (Dioscorea opposita) đƣợc sử dụng độc lập hay kết hợp với β1,3-glucanase bằng cách phun trực tiếp lên bề mặt quả dâu tây và lá bị nhiễm bệnh phấn trắng.
Kết quả cho thấy việc sử dụng chitinase trong điều trị bệnh phấn trắng đạt hiệu quả trong việc
hồi phục sức khỏe của các cây dâu tây bị nhiễm nấm mốc và bệnh không tái xuất hiện trong
hơn hai tuần (Karasuda và cs, 2003).

d. Thu nhận tế bào trần
Tế bào trần của nấm đã đƣợc sử dụng hiệu quả trong việc nghiên cứu quá trình hình
thành thành tế bào, quá trình tổng hợp enzyme, quá trình bài tiết các chất cũng nhƣ việc cải
thiện các chủng nấm ứng dụng trong công nghệ sinh học. Do trong thành tế bào nấm có chứa
chitin, hệ enzyme thủy phân chitin là một trong những nhân tố có thể sử dụng để phá vỡ
thành tế bào, tạo tế bào trần từ tế bào nấm. Dahiya và cs (2005) đã mô tả hiệu quả của
14