(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb ex murray) trevis) thu tại lào cai và lâm đồng
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.76 MB, 157 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ LAN ANH
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ
NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA
(Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS)
THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội – 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
LÊ THỊ LAN ANH
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ
NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA
(Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS)
THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9.42.02.01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Lê Thị Bích Thủy
2. GS. TS. Nguyễn Đức Thành
Hà Nội – 2021
i
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Luận án là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với
một số cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được cơng bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành, các hội nghị trong nước và
quốc tế với sự đồng ý sử dụng số liệu của các đồng tác giả.
Những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất
kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày
tháng năm 2021
Nghiên cứu sinh
Lê Thị Lan Anh
ii
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của
mình đến GS. TS. Nguyễn Đức Thành và TS. Lê Thị Bích Thủy, phịng Di truyền Tế
bào Thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, những người thầy đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, hướng dẫn
khoa học và định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu
và hồn thành luận án.
Tơi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô tại Viện Công nghệ sinh học đã
giảng dạy, cung cấp kiến thức mới để tơi hồn thành các học phần và các chun đề
trong chương trình đào tạo.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ
đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành các nội dung trong chương trình đào
tạo.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Ngô Văn Vụ - Hiệu trưởng
trường Cao Đẳng Sư Phạm Hà Tây, các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường,
các thầy cô trong các Khoa, Phịng, Ban nơi tơi cơng tác đã tạo mọi điều kiện tốt
nhất, hỗ trợ và giúp đỡ tôi hồn thành nhiệm vụ chun mơn tại trường trong suốt
thời gian tôi đi học.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Tế bào Thực vật,
Viện Công Nghệ sinh học, tập thể các cán bộ thuộc Vườn Quốc gia Hoàng Liên và
Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, hỗ trợ, giúp đỡ và chia sẻ
kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào
tạo ở Viện Công nghệ sinh học và Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm ở Học viện
Khoa học và Cơng nghệ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn thành các hồ sơ
trong q trình học tập.
Tơi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong
khn khổ đề tài Quỹ gen - Bộ Khoa học và Cơng nghệ: “Khai thác và phát triển
nguồn gen lồi Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trev.) tại Sapa và
Đà Lạt”.
Cuối cùng, với tất cả lịng biết ơn tơi xin gửi đến gia đình, người thân và bạn
bè đã ln tin tưởng, thông cảm, quan tâm, hỗ trợ và động viên tơi trong suốt thời
gian qua để tơi có thể hồn thành tốt nhiệm vụ học tập và cơng tác chuyên môn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Nghiên cứu sinh
Lê Thị Lan Anh
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...............................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài .................................................... 2
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................2
2.2. Nội dung nghiên cứu .....................................................................................2
3. Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................ 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .......................................................................... 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ...........................................................................................3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...........................................................................................3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................5
1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) .............................. 5
1.1.1. Phân loại .....................................................................................................5
1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa ......................................6
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa ..............................7
1.1.4. Đặc điểm sinh sản .....................................................................................10
1.1.5. Đặc điểm hóa sinh .................................................................................... 11
1.1.6. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Thạch tùng răng cưa ..............14
1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa ................ 15
1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA ..........................................................15
1.2.2. Thành phần, cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học của HupA ....................18
1.2.3. Các nghiên cứu về tách chiết và xác định hàm lượng HupA ...................20
1.2.4. Vai trò của HupA trong y học ...................................................................22
1.2.5. Dược động học của HupA ........................................................................23
1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở
Việt Nam........................................................................................................ 25
iv
1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới ......25
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam .......30
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................31
2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................... 31
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................31
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ...................................................................................32
2.1.3. Môi trường nuôi cấy .................................................................................33
2.1.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm .............................................................33
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 34
2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng
răng cưa .................................................................................................................34
2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa ........................................39
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................46
3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ... 46
3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ......................46
3.1.2. Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng răng cưa .....................................49
3.1.3. Đánh giá đặc điểm sinh thái học của Thạch tùng răng cưa ......................51
3.1.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa bằng chỉ thị
phân tử RAPD .......................................................................................................53
3.1.5. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai
và Lâm Đồng. .......................................................................................................59
3.2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa ................................................................ 68
3.2.1. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân .........68
3.2.2. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô .............88
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................107
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ ..................................................109
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 110
PHỤ LỤC
v
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ACh
Acetylcholine
Axetylcholin
AChE
Acetylcholinesterase
Enzym acetylcholinesteraza
AD
Alzheimer’s disease
Bệnh Alzheimer
AFLP
Amplified fragment length
Đa hình chiều dài của đoạn
polymorphism
được khuếch đại.
BA
6-benzyladenin
6-benzyladenin
BuChE
Butyrylcholinesterase
Enzym butyrylcholinesteraza
CTAB
Cetyltrimethyl
Xetyltrimethyl amoniumbromit
amoniumbromide
CYP
Cytochrome P450
Xytochrom P450
DNA
Deoxyribonucleic acid
Axit deoxyribonucleic
dNTP
Deoxyribonucleoside
Deoxyribonucleosit triphosphat
triphosphate
EDTA
Ethylene diamin tetra acetate
Ethylene diamin tetra axetat
HPLC
High performance liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
chromatography
HupA
Huperzine A
Huperzin A
H. serrata
Huperzia serrata
Thạch tùng răng cưa
IAA
β-indole acetic acid
Axit β-indole acetic
IBA
Indole-3-butyric acid
Axit indole-3-butyric
IC50
The half maximal inhibitory
Nồng độ ức chế tối đa một nửa
concentration
Kb
Kilobase
Kilo bazơ
LC-MS
Liquid chromatography-mass
Sắc ký lỏng khối phổ
spectrometry
MS
Murashige and Skoog medium
Môi trường Murashige và
Skoog
NAA
Naphthaleneacetic acid
Axit naphthaleneacetic
vi
Chữ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
OD
Optical density
Mật độ quang
PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi polymeraza
Phy
Physostigmine
Physostigmin
RAPD
Random amplified
Đa hình phân đoạn DNA được
polymorphic DNA
nhân bản ngẫu nhiên
Rf
Rentention factor
Hệ số di chuyển
RNase
Ribonuclease
Enzim ribonucleaza
SD
Standard deviation
Độ lệch tiêu chuẩn
TE
Tris EDTA
Tris EDTA
THA
Tetrahydroaminoacridine
Tetrahydroaminoacridin
TLC
Thin layer chromatography
Sắc ký bản mỏng
UPLC - MS
Ultra performance liquid
Sắc ký lỏng siêu áp ghép đầu
chromatography - mass
dò khối phổ
Spectrometry
UPLC-PDA
Ultra performance liquid
Sắc ký lỏng siêu áp với đầu dò
chromatography- photodiode
PDA
array
UPLC-Q/TOF/
Ultra performance liquid
Sắc ký lỏng siêu áp/ phương
MS
chromatography/ quadrupole
pháp quang phổi khối thời gian
time of flight/ mass
chạy tứ cực
spectrometry
UV
Ultra violet
Tia tử ngoại
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1.
Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu……………………… …32
Bảng 2.2.
Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu... …36
Bảng 2.3.
Các môi trường ni cấy mơ sẹo………………………………………43
Bảng 3.1.
Đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu ở Lâm Đồng và
Lào Cai……………………………………………………………..…46
Bảng 3.2.
Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16
mồi RAPD…………………………………………………………..…55
Bảng 3.3.
Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa……….…56
Bảng 3.4.
Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu
Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 (mùa thu).……….............…64
Bảng 3.5.
Hàm lượng HupA của rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa………….…66
Bảng 3.6.
Ảnh hưởng của chiều dài hom thân đến sự sinh trưởng của cây
con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng
giâm hom………………………………………………………………69
Bảng 3.7.
Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sinh trưởng của cây con
Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm tại Lâm Đồng và Lào Cai….…71
Bảng 3.8.
Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của
cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lâm
Đồng………………………………………………………………..…74
Bảng 3.9.
Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây
con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lào Cai….…76
Bảng 3.10. So sánh hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát
triển của hom thân Thạch tùng răng cưa ở hai vùng nghiên cứu……....78
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm đến sinh trưởng cây con
Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng……….…80
Bảng 3.12. So sánh hiệu quả giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai
và Lâm Đồng sau 4 tháng…………………………………...........…..81
Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con sau 2 tháng bón phân tại Lâm Đồng….…83
Bảng 3.14. Sự tăng trưởng của cây con trong bầu ươm ở các thời gian khác
nhau………………………………………………………………….
…84
viii
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian ra ngôi đến sinh trưởng cây con
Thạch tùng răng cưa……………………………………………….…..85
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng răng cưa
sau 30 ngày nuôi cấy……………………………………………….…89
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường khống đến ni cấy chồi Thạch
tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy……………………………………91
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của BA đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau
120 ngày nuôi cấy…………………………………………………..…93
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của Kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng
cưa sau 120 ngày nuôi cấy……………………………………………94
Bảng 3.20. So sánh hiệu quả của BA và kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng
răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy……………………………………..…95
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa sau
60 ngày nuôi cấy…………………………………………………….…96
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của α - NAA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng
cưa sau 60 ngày nuôi cấy.…………………………………………..…97
Bảng 3.23. So sánh hiệu qủa của α - NAA và IBA đến sự phát triển rễ sau
60 ngày nuôi cấy…………………………………………………..…97
Bảng 3.24. Kết quả nuôi cấy mô sẹo Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng………....100
Bảng 3.25. Tạo đa chồi mô sẹo Thạch tùng răng cưa trên mơi trường
¼ MS + 1 mg/l kinetin sau 4 tháng…………………………….........102
ix
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.
Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata………………………………..…..6
Hình 1.2.
Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới………………….…..7
Hình 1.3.
Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam……………………..8
Hình 1.4.
Hình thái của cây mầm ở các độ tuổi khác nhau………………………10
Hình 1.5.
Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của lycopodium alkaloid thu
từ lồi Thạch tùng răng cưa……………………………………………12
Hình 1.6.
Các hợp chất khác từ lồi Thạch tùng răng cưa…………………….…13
Hình 1.7.
Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b)……….…13
Hình 1.8.
Con đường sinh tổng hợp của HupA..................................................
…..18
Hình 1.9.
Các đồng phân quang học của HupA……………………………….…18
Hình 1.10. Cấu trúc tương tự của HupA và acetylcholine (ACh)…………………19
Hình 1.11. Cấu trúc phân tử HupA……...…………………………………………19
Hình 1.12. Các tương tác chính giữa AchE và phân tử HupA ………………….…20
Hình 2.1.
Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lào Cai…………………………………..…31
Hình 2.2.
Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lâm Đồng……………………………….…31
Hình 2.3.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qt…………………………………..…34
Hình 3.1.
Hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng ….……………47
Hình 3.2.
Một số hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai………....…47
Hình 3.3.
Cây Thạch tùng răng cưa trong rừng tại Lâm Đồng…………………
…48
Hình 3.4.
Đế mầm trên cây Thạch tùng răng cưa mẹ…………………………...
…49
Hình 3.5.
Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai………………….…50
Hình 3.6.
Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng…………………50
Hình 3.7.
Vi phẫu lá Thạch tùng răng cưa…………………………………… …51
Hình 3.8.
Thạch tùng răng cưa trên bờ suối tại Nam Ban, Lâm Đồng.................
…51
Hình 3.9.
Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với
mồi OPC5.…………………………………………………………..…54
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với
mồi OPC13…………………………………………………………..
…54
Hình 3.11. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với
mồi OPB13……………………………………............................……54
Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa..……………56
Hình 3.13. Hình ảnh chạy TLC HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa………….…60
Hình 3.14. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại DL1…....…61
x
Hình 3.15. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai..…62
Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết
lá Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai……………………………..…62
Hình 3.17. Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết
lá cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng…………………….. …63
Hình 3.18. Phổ ESI - MS Positive và peak ion phân tử 243,0………………… …63
Hình 3.19. Cây con Thạch tùng răng cưa trong vườn ươm…………………….…81
Hình 3.20. Cây Thạch tùng răng cưa ngồi vườn ươm tại Lâm Đồng………….…85
Hình 3.21. Sơ đồ một số khâu cơ bản trong quy trình nhân giống Thạch tùng
răng cưa bằng giâm hom thân……………………………………..…86
Hình 3.22. Mẫu Thạch tùng răng cưa sau 30 ngày nuôi cấy in vitro trên mơi
trường MS ………………………………………………………….…90
Hình 3.23. Chồi Thạch tùng răng cưa ni cấy trên mơi trường ¼ MS………...…92
Hình 3.24. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa ni cấy trên mơi trường ¼ MS có
bổ sung 1 mg/l kinetin……………………………………………….…95
Hình 3.25. Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy trong môi trường
1/4 MS có bổ sung 1 mg/l IBA……………………………………...…98
Hình 3.26. Cây Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày ni cấy trong nhà kính…. …98
Hình 3.27. Ni cấy mơ sẹo đỉnh chồi Thạch tùng răng cưa trên mơi trường
¼ MS + 0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/l kinetin + 3 mg/l glutamin……....101
Hình 3.28. Đa chồi hình thành từ mơ sẹo sau 30 ngày ni cấy trên mơi
trường ¼ MS………………………………………………………....101
Hình 3.29. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa được hình thành từ mơ sẹo sau 4
tháng ni cấy……........................................................................... ..103
Hình 3.30. Cây Thạch tùng răng cưa in vitro nuôi cấy trên môi trường 1/4 MS
+ 1 mg/l IBA………………………………………………………. ..103
Hình 3.31. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết
toàn bộ cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2019.....................105
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, trước những tác động lớn của biến đổi khí hậu, dịch bệnh và sự
khai thác quá mức của con người, vấn đề nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn
gen các lồi cây trồng nói chung, trong đó có các loại cây dược liệu đang là vấn đề
được khoa học và xã hội quan tâm.
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) là loại cây dược liệu quý, thuộc
danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý
hiếm về cây thuốc. Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa là huperzine A
(HupA) có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt là bệnh
Alzheimer ở người già [1]. Với kết quả nghiên cứu và phát hiện về tác dụng tuyệt
vời của HupA dựa trên kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học phương tây đã cho
thấy triển vọng phát triển các loại thuốc chữa bệnh Alzheimer từ loài cây này [2].
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, số lượng người có vấn đề về suy giảm trí
nhớ nói chung và người mắc bệnh Alzheimer nói riêng đang ngày một tăng cao, nhu
cầu về thuốc thảo dược có chứa hoạt chất HupA vì thế khơng ngừng tăng, đây có
thể là ngun nhân chính dẫn đến việc khai thác quá mức làm suy giảm nghiêm
trọng nguồn gen loài cây dược liệu quý này trong tự nhiên. Do đó, trên thế giới đã
có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình
thức giâm hom thân và ni cấy mô nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây
này.
Các nghiên cứu cho thấy, loài Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tốt trong rừng
với đất mùn ẩm ướt, độ cao 350 - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm/ năm, độ ẩm
trên 78% [3, 4]... Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa đã được tìm thấy trên các vùng
cao tại một số khu vực như Lào Cai, Lâm Đồng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Nghệ An,
Tây Nguyên, Quảng Trị…[5]. Trong đó, Lâm Đồng và Lào Cai là hai khu vực có
điều kiện khí hậu và mơi trường sống thích hợp hơn cho sự phát triển của loài
Thạch tùng răng cưa so với các khu vực khác trong cả nước. Tuy nhiên, Thạch tùng
răng cưa có đặc tính sinh trưởng chậm, khả năng sinh sản kém, mức khai thác
nguồn cây trồng tự nhiên quá lớn đã làm mất dần nguồn gen quý này ở nước ta, dẫn
đến loài Thạch tùng răng cưa không đáp ứng được nhu cầu về nguồn nguyên liệu
2
cho sản xuất dược phẩm. Do vậy, để chủ động nguồn dược liệu cho chiết xuất hoạt
chất HupA dùng làm thuốc, việc nghiên cứu một số đặc điểm sinh học để lựa chọn
giống cây có khả năng sinh tổng hợp HupA cao, từ đó tìm ra các phương pháp để tái
sinh và nhân giống nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen lồi cây này là vơ cùng
cần thiết. Hơn nữa, Việt Nam cũng chưa có cơng trình nghiên cứu nào thành cơng
về nhân giống lồi Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn. Xuất phát từ thực tế và
nhận định trên, chúng tôi lựa chọn hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai để thực hiện đề
tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng
cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm
Đồng”.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân tích một số đặc điểm sinh học và xác định được các điều kiện thích hợp
cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom thân, ni cấy mơ) lồi Thạch tùng
răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen
loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.
2.2. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh thái học và tính đa hình
DNA của lồi Thạch tùng răng cưa.
i. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của lồi Thạch tùng răng cưa.
ii. Đặc điểm sinh thái học của loài Thạch tùng răng cưa.
iii. Tính đa hình DNA của lồi Thạch tùng răng cưa.
2. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự
nhiên thu thập tại Lào Cai và Lâm Đồng.
3. Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa.
i. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân.
ii. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức ni cấy mơ.
4. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy
3
mơ.
3. Những đóng góp mới của đề tài
Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống khi kết hợp cùng lúc phương pháp
phân tích về hình thái, giải phẫu thực vật và sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa
dạng nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng.
Xác định được hàm lượng HupA trong 8 mẫu nguồn gen loài Thạch tùng
răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, trong đó, các mẫu Thạch tùng răng cưa thu
tại Lâm Đồng có hàm lượng HupA (90,23 µg/g) cao hơn so với các mẫu thu tại Lào
Cai (76,28 µg/g); hàm lượng HupA ở lá cao hơn thân và rễ; lá Thạch tùng răng cưa
thu hái vào mùa thu (tháng 9) có hàm lượng HupA (92,50 µg/g) cao hơn thu hái vào
mùa xuân (tháng 3) (75,10 µg/g).
Đã xác định được một số khâu cơ bản làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình
nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom thân (tại Lào Cai
và Lâm Đồng) với tỉ lệ cây hồi xanh sau ra ngôi đạt 97,78% và phương pháp ni
cấy mơ với tỉ lệ sống sót trên giá thể đạt 97%; đồng thời, xác định được hàm lượng
HupA trong cây ni cấy mơ đạt 300 µg/ g khối lượng khô.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của luận án cung cấp các thơng tin khoa học về đặc điểm hình thái,
tính đa dạng về hệ gen, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa ở hai vùng
Lào Cai và Lâm Đồng.
Cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về ứng dụng công nghệ tế bào
thực vật trong nhân giống, mở ra triển vọng đáp ứng nguồn cây giống đồng đều và
chất lượng cho phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học có ý nghĩa định hướng cho công
tác bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam.
Xác định được thời điểm thu hoạch và bộ phận thu hái Thạch tùng răng cưa
để nhận được hàm lượng HupA cao nhất phục vụ cho y học; đồng thời, giảm thiểu
4
được việc khai thác dẫn đến mất dần nguồn gen Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên.
Thành công trong phương pháp nhân giống sẽ góp phần bảo tồn và phát triển
nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa tại các vùng có khả năng trồng ở Việt Nam,
cung cấp nguyên liệu có hoạt chất HupA cao phục vụ cho việc sản xuất thuốc điều
trị các bệnh rối loạn về trí nhớ.
5
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata)
1.1.1. Phân loại
Thạch tùng răng cưa tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray)
Trevis, (trước đây gọi là Lycopodium serratum Trevis, Huperziaceae), thuộc bộ
Lycopodiales, họ Lycopodiaceae, chi Huperzia. Chi Huperzia có khoảng 500 lồi
trên tồn thế giới [6, 7].
Ở Việt Nam, họ Lycopodiaceae có 3 chi là Huperzia, Lycopodium và
Lycopodiella với tổng số 14 loài. Trong đó, chi Huperzia là chi lớn nhất với 10
lồi gồm Huperzia cancellata (Spring) Trevis., H. carinata (Poir.) Trevis, H.
chinense (Christ) Ching, H. hamitolnii (Spring) Trevis, H. subdisticha Mak, H.
obovalofolia (Bon.), H. plegmaria (L.) Roth., H. salvinoides (Herter) Alston., H.
serrata (Thunb.) Trevis và H. squarrosa (Forst.) Trevis [8, 9, 10]. Đây là những
lồi được đánh giá có tiềm năng sử dụng trong điều trị nhiều bệnh như Alzheimer,
Parkinson, đau, sưng tấy, phát ban, tâm thần phân liệt và bệnh nhược cơ ở các nước
Đông Á [5].
Theo Nguyễn Thọ Biên (2017), họ Lycopodiaceae ở Việt Nam gồm 12 lồi
có tác dụng chữa bệnh, trong đó có 11 lồi được phát hiện ở tỉnh Lâm Đồng: Thạch
tùng (thông đá, thăng kim thảo - Lycopodium clavatum L.); Thạch tùng nhiều bông
(Huperzia chinense (H. Chirst) Ching); Thạch tùng phi lao (Lycopodium
casuarinoides Spring); Thạch tùng răng cưa (H. serrata (Thunb.) Trevis); Thạch
tùng thân gập (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis); Thạch tùng xoan ngược
(Huperzia abovalifolia (Bon); Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm);
Thông đất dẹp (Lycopodium complanatum L.); Thông đất Haminton (Huperzia
hamilltonii (Spreng.) Trevis); Thông đất râu (Huperzia plegmaria (L.) Rothm);
Thông đất song (Huperzia carinata (Desv. Ex Poir.) Trevis [11]; Thạch tùng Ford
(Huperzia fordii (Backer) R. D. Dixit) chỉ gặp ở vùng núi thấp của Hà Nội (Ba Vì)
[12]. Bốn trong số 12 lồi trên đã được đưa vào danh mục cây thuốc Việt Nam
(2016) gồm: Thạch tùng Ford, Thạch tùng nhiều bông, Thạch tùng phi lao, Thạch
tùng răng cưa [12].
6
1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa
Thạch tùng răng cưa (Hình 1.1) thuộc lồi thân cỏ mọc ở đất, thân cao 15 cm
- 40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1 - 2 lần, hình trụ, đường kính khoảng 2 mm. Lá
hình bầu dục, mũi mác, dài 15 mm, rộng 3 mm, phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân
giữa, mép lá có răng cưa, rễ dạng chùm [13]. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Phạm
Hoàng Hộ (2006), cây Thạch tùng răng cưa thu ở Sa Pa và Đà Lạt có đặc điểm là:
thân đứng, cao 8 cm - 20 cm, lá thon hẹp, kích thước 2 – 3 cm x 0,40 cm, tương đối
mỏng, gân rõ giữa, bìa có răng khơng đều. Bào tử nang ở nách lá khơng khác lá
thường, hình thận, màu vàng tươi [14]. Sự phát triển của túi bào tử từ lúc bắt đầu
đến khi trưởng thành mất gần 1 năm. Cấu trúc của thành túi bào tử trưởng thành bao
gồm một lớp biểu bì, ở giữa là hai lớp tế bào và một lớp mô dưỡng chất gọi là
tapetum. Do đó, túi bào tử của lồi Thạch tùng răng cưa thuộc loại túi bào tử dày
(eusporangium) [15]. Bào tử được phát tán ra khi túi bào tử trưởng thành. Mầm tập
trung nhiều ở phần trên của cây và những mầm này có thể phát triển thành cây mới
sau khi rơi xuống đất. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cưa ít khi được nhân giống bằng
mầm [16].
Bào tử
Thân
Lá
Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata [17].
Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ở khu bảo tồn
thiên nhiên Bắc Hướng Hóa - Quảng Trị cho thấy cây trưởng thành là những cây có
khả năng sản sinh bào tử nang có màu vàng tươi, hình thận với kích thước 0,8 mm
mọc ở nách lá. Ngược lại, cây tái sinh thường chưa sản sinh bào tử nang, chiều cao
và đường kính nhỏ hơn cây trưởng thành, với chiều cao 3,54 cm, đường kính 0,75
7
mm. Đối với cây trưởng thành có dạng cây thân thảo đứng có chiều cao trung bình
11,89 cm - 14,25 cm, đường kính thân trung bình 1,80 mm. Lá có hình dạng lưỡi
mác, chiều dài 1,84 cm - 2,57 cm, chiều rộng 0,37 cm - 0,41 cm, gân giữa nổi rõ,
mép lá có răng cưa khơng đều với số lá trung bình 79,80 lá/ cây [18].
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa
Thạch tùng răng cưa phân bố trên toàn thế giới nhưng tập trung nhiều nhất ở
khu vực ơn đới phía đơng, phía nam đến vùng nhiệt đới Đông Nam của Châu Á,
cũng như Châu Đại Dương và Trung Mỹ (Hình 1.2) [19]. Chúng sống bì sinh ở
những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, phát triển tốt trong rừng hoặc trong khe
núi với đất mùn ẩm ướt, ở độ cao 350 m - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm, độ ẩm
tương đối cao 78%, hàm lượng nước trong đất 10% - 30%, pH đất 4,57 - 5,31, độ
dẫn đất 0,06 - 0,85 cm/ cm, và hàm lượng chất hữu cơ 6,18% - 9,75% [3, 4].
Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới [20].
Theo nghiên cứu của Kaur và cộng sự (2016), Thạch tùng răng cưa chủ yếu
được tìm thấy ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Việt Nam, Indonesia, Fiji, Samoa, Mexico, Mỹ, Thái Lan, bán đảo Malaysia,
Nga, Đài Loan, Úc và Cuba. Ấn Độ phát hiện được 21 loài thuộc chi Huperzia.
Trong đó, 6 lồi bao gồm Huperzia cancellta (Spring) Trevis., H. carinata (Desv.)
Trevis., H. quasipolytrichoides (Hayata) Ching (H. cryptomerina sensu Dixit), H.
nummulariifolia (Blume) Jermy, H. phyllantha (Hook & Arn) Holub và H.
vernicosa (Hook & Grev.) Trevis bị đe dọa nghiêm trọng và bốn loài là H. ceylanica
(Spring) Trevis., H. nilagirica (Spring) Dixit., H. selago (Linn) Bernh. Ex Schrenk
& Mart subsp arctica (Grossh ex. Tolm.) A. Love & D. Love (H. dixitiana P.
Mondal & S. R. Ghosh) và H. phlemaria (Linn) Rothm. (Phlegmariurus Plegmaria
8
(Linn.) Sen & Sen) xuất hiện với tỉ lệ hiếm. Thạch tùng răng cưa chủ yếu được tìm
thấy ở vùng cận nhiệt đới đến rừng ôn đới ở độ cao 900 m - 3500 m khu vực Đông
Bắc của Ấn Độ như West Bengal (Darjeeling), Meghalaya, Manipur và đồi Nilgiri
của Tamilnadu [21].
Ở Trung Quốc, Thạch tùng răng cưa chủ yếu xuất hiện trong rừng lá rộng
thường xanh, tập trung nhiều ở các khu vực từ vùng phía Nam đến sơng Dương Tử;
nơi đây, lượng mưa hàng năm trên 1000 mm và chúng thường sinh trưởng trong các
môi trường được che bóng, ẩm ướt và đất mùn axit, ở độ cao dao động từ 300 đến
2700 m [4].
Ở nước ta, cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc
cây hoặc bề mặt đá. Cây thường phân bố ở độ cao trên 1000 m so với mực nước
biển. Cây phát triển tốt trong mơi trường bóng mờ, ẩm ướt và rất ẩm ướt, đất có
nguồn chất hữu cơ phong phú, độ mùn cao, điều này làm hạn chế mơi trường sống
của chúng ở các vùng có độ cao cao hơn tại Việt Nam [22]. Chúng phân bố rải rác
tại các vùng cao như Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng
Nam - Đà Nẵng, Khánh Hịa, Tam Đảo [5, 8] (Hình 1.3).
Hình 1.3. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam [20].
Từ Bắc vào Nam, bốn quần thể bản địa của loài này phân bố tại các khu bảo
tồn thiên nhiên đã được xác định ở Việt Nam bao gồm Vườn Quốc gia Hoàng Liên
(tỉnh Lào Cai), Vườn Quốc gia Bạch Mã (tỉnh Thừa Thiên Huế), Khu bảo tồn Quốc
9
gia Ngọc Linh (giữa Tỉnh Quảng Nam và Kon Tum) và Vườn Quốc gia Bidoup (tỉnh
Lâm Đồng). Trong năm 2013 và 2016, nghiên cứu định danh tại hiện trường đã xác
định được 100 - 300 cá thể còn lại ở mỗi khu vực nghiên cứu. Kết quả ghi nhận này
cho thấy, kích thước của quần thể và sự tái sinh khan hiếm của loài cây Thạch tùng
răng cưa trở thành một mối đe dọa lớn đối với sự tồn tại của lồi, thơng qua sự suy
giảm đa dạng di truyền [22].
Bên cạnh đó, tại khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa (Quảng Trị), Trần
Mạnh Đạt và cộng sự (2019) đã nghiên cứu và xác định loài Thạch tùng răng cưa tại
đây phân bố ở đai cao từ 1.400 m - 1.500 m so với mặt nước biển, chủ yếu ở vị trí
sườn dốc và địa hình ven khe suối, tập trung nhất ở vị trí ven khe suối (78,09%) ở
vùng Pa Thiên với độ dốc dưới 30o và những vị trí sườn dốc cũng thấy sự xuất hiện
phân bố của lồi nhưng ít hơn chỉ đạt 21,91% với độ dốc địa hình lớn hơn 30o, chưa
bắt gặp cá thể nào phân bố ở đỉnh núi. Ngoài ra, cây phân bố tập trung ở những khu
vực có độ ẩm cao trong rừng, thường phân bố theo các đám nhỏ tại những điểm
bằng phẳng cục bộ trong rừng do bị giới hạn bởi có đá chắn, bạt chắn ven suối, cạnh
các tảng đá, bờ suối với tỷ lệ đá nổi từ 10% đến 20%. Vùng phân bố tập trung được
ghi nhận ở khu vực động Pa Thiên, núi Voi Mẹp (xã Hướng Sơn) và La Rường (xã
Hướng Linh) của Khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa. Mật độ trung bình 98
cây/ km, tần số bắt gặp 5 - 20 cây/ km của tuyến điều tra. Trạng thái rừng có cây
Thạch tùng răng cưa phân bố đều thuộc trạng thái rừng giàu, nguyên sinh ít bị tác
động với độ tàn che cao 0,70 - 0,80 [18].
Các nghiên cứu cho thấy, cây Thạch tùng răng cưa có chứa nhiều lồi nấm
nội sinh [23, 24, 25]. Các loại nấm nội sinh này thường không gây ra triệu chứng rõ
ràng về bệnh; ngược lại, chúng kích thích sự tăng trưởng của thực vật và tăng cường
khả năng sống sót của vật chủ đối với nấm gây bệnh [23]. Một số nấm nội sinh
được phát hiện như một nguồn thuốc chữa bệnh như chủng nấm Botryosphaeria sp.
P483 [26], Aspergillus versicolor [27], hoặc chứa các hợp chất mới như chủng B14
thuộc lồi nấm Penicillium oxalicum có chứa hợp chất pentapeptit mới [28], chủng
Penicillium chrysogenum MT-12 có chứa axit 3,5-dimethylorsellinic bắt nguồn từ
nhóm hợp chất meroterpenoid [29], bốn hợp chất steroid mới là neocyclocitrinol
E-G (1-3) và 3β-hydroxy-5,9-epoxy-(22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one được phát
10
hiện trong chủng nấm Chaetonium sp. M453 [30]. Điều này cho thấy, lồi Thạch
tùng răng cưa có chứa nhiều chủng nấm nội sinh khác nhau và đây là một nguồn tài
nguyên phong phú cho việc khảo sát các sản phẩm tự nhiên mới.
1.1.4. Đặc điểm sinh sản
Loài Thạch tùng răng cưa có sự kết hợp cả hình thức sinh sản hữu tính (bằng
bào tử) và sinh sản vơ tính (bằng mầm).
Cây trưởng thành tạo ra các lá mới, túi bào tử từ tháng 2 đến tháng 3, và
thường túi bào tử mở để giải phóng bào tử vào tháng 12 và tháng 1 năm sau [19].
Quá trình phát triển của bào tử và túi bào tử kéo dài hơn 1 năm. Sự phát triển của túi
bào tử được xác định gồm sáu giai đoạn: (1) bắt đầu từ tế bào biểu bì và hình thành
các tế bào sinh bào tử, (2) tế bào sinh bào tử nguyên sinh, (3) tế bào sinh bào tử thứ
cấp, (4) tế bào bào tử mẹ, (5) giai đoạn bốn bào tử (tetrad) và (6) trưởng thành [15].
Các thể giao tử và thể bào tử của Thạch tùng răng cưa thường phát triển chậm trong
môi trường sống có độ ẩm tương đối cao và cần nguồn chất hữu cơ phong phú nên
khó khăn trong việc nhân giống [31]. Không chỉ vậy, sau khi bào tử nảy mầm, cây
con phải mất 15 - 20 năm để phát triển đạt chiều cao 10 - 30 cm. Cho đến nay, trên
thế giới chưa có cơng trình nào thành cơng với phương pháp nảy mầm bào tử trong
phịng thí nghiệm [17, 32].
Hình 1.4. Hình thái của cây mầm ở các độ tuổi khác nhau [19].
Trong tự nhiên, sinh sản sinh dưỡng bằng mầm đóng vai trị quan trọng đối
với việc phát tán và tái sinh loài Thạch tùng răng cưa [19]. Nghiên cứu cho thấy cây
Thạch tùng răng cưa trưởng thành tạo ra mầm từ tháng 2 đến tháng 3, sau đó mầm
rơi xuống đất trong khoảng thời gian từ tháng 8 đến tháng 10. Các mầm dễ dàng
11
phát triển thành cây con trên môi trường đất rừng sinh thái. Sau 3 hoặc 4 ngày, mầm
đã xuất hiện các rễ rất ngắn (< 0,10 mm). Sau 7 ngày, cây con phát triển một hoặc
hai lá ban đầu. Sau 120 ngày, các lá hình thành răng cưa (Hình 1.4) [19]. Nghiên
cứu cũng chỉ ra rằng cây Thạch tùng răng cưa lâu năm với trên ba lớp mầm (cây
trên 3 năm tuổi, mỗi lớp mầm tương ứng với 1 năm tuổi) thì khả năng tạo mầm trở
lên mạnh mẽ hơn, trung bình tạo ra hơn 20 mầm mỗi năm [19]. Tuy nhiên, trên thực
tế, Thạch tùng răng cưa ít khi được nhân giống bằng mầm [16]. Điều này cho thấy
mầm của loài Thạch tùng răng cưa thường được phát triển thành cây con trong môi
trường tự nhiên với tỉ lệ sống sót cao. Đây là một trong những hình thức sinh sản
giúp duy trì và phát triển nguồn gen lồi Thạch tùng răng cưa trong điều kiện tự
nhiên.
1.1.5. Đặc điểm hóa sinh
Thế giới đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hoá
học và tác dụng bảo vệ thần kinh của các hợp chất phân lập được từ cây Thạch tùng
răng cưa [33, 34]. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng lycopodium alkaloid là
thành phần hố học chính trong cây và có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh [35].
Cao chiết giàu alkaloit từ Thạch tùng răng cưa thu tại Nhật Bản có khả năng ức chế
enzyme AchE với giá trị IC50 là 5,96 µg/ ml [33]. Tại Việt Nam, Nguyễn Duy Tài và
cộng sự (2013) đã nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của cao chiết cồn
từ lồi Thạch tùng răng cưa thuộc họ Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng. Kết quả
cho thấy cao chiết cồn của Thạch tùng răng (liều 0,53 g/ kg) giúp cải thiện tình
trạng suy giảm trí nhớ trên chuột thực nghiệm. LD50 của cao Thạch tùng răng cưa là
5,33 g/ kg [36]. Cao chiết toàn phần, các phân đoạn cao chiết và cao chiết alkaloit
được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa thu tại Việt Nam đều có tác dụng ức chế
enzyme AchE. Trong đó, cao chiết giàu alkaloit thể hiện tác dụng ức chế enzyme
AchE và BuchE mạnh hơn hẳn so với các cao chiết toàn phần và các phân đoạn cao
chiết với giá trị IC50 lần lượt là 14,08 µg/ml và 88,11 µg/ml [37].
Sử dụng phương pháp UPLC - MS, Wu và cộng sự (2018) đã xác định được
một trăm mười tám hợp chất lycopodium alkaloid trong các mô khác nhau của loài
Thạch tùng răng cưa [38]. Một số hợp chất lycopodium alkaloid với cấu trúc hóa
học đa dạng được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa vẫn đang được các nhà khoa
12
học nghiên cứu để xây dựng nên cấu trúc các hợp chất alkaloid mới. Đa số các
lycopodium alkaloid là các chất hòa tan trong chất béo và chúng được phân thành
bốn loại cấu trúc chính (Hình 1.5). Bốn loại cấu trúc chính bao gồm các nhóm:
fawcettimine, lycodine, lycopodine và một tập hợp các hợp chất hỗn hợp
(miscellaneous) [1].
Hình 1.5. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của lycopodium alkaloid thu từ loài
Thạch tùng răng cưa [1].
Hầu hết các hợp chất alkaloid có khả năng ức chế enzyme
acetylcholinesterase (AchE) thuộc về lớp lycodine (B) gồm có: HupA,
6-β-hydroxyhuperzine A, huperzine B (HupB), N-methylhuperzine B và
huperzinine [39, 40]. Bằng kỹ thuật UPLC-PDA và UPLC-Q/TOF-MS, Zhao và
cộng sự (2015) đã xác định nhanh 3 hợp chất có mặt trong cây Thạch tùng răng cưa
là HupA, HupB và HupC [41]. Đối với vấn đề ức chế AchE thì HupA là hợp chất
quan trọng có khả năng ức chế mạnh nhất [33, 40]. Nghiên cứu khác đã chứng minh
một vài lycopodium alkaloid thuộc nhóm fawcettimine cũng có khả năng ức chế
AchE như huperzine P và huperzine R nhưng khả năng ức chế của chúng thấp hơn
HupA
[42].
Ngược
7-hydroperoxyphlegmariurine B
lại,
11-α-hydroperoxyphlegmariurine
và phlegmariurine
B,
B cũng thuộc nhóm
fawcettimine lại khơng có khả năng ức chế hoạt động của enzyme AchE [43]. Một
hợp chất lycopodium alkaloid khác là 12-deoxyhuperzine O thuộc nhóm lycopodine
cũng được tìm thấy trong cây Thạch tùng răng cưa, đây là một chất đối kháng của
13
thụ thể N-methyl-D-aspartate (NMDA) [44].
Ngoài các hợp chất lycopodium alkaloid đã được khảo sát rộng rãi, cây
Thạch tùng răng cưa cịn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên khác như
nhóm
triterpene:
Serrat-14-en-3β,21α,29-triol
[45];
Flavon:5,5’-dihydroxy-2’,4’-dimethoxyflavone-7-О-β-D-(6’’-O-Z-p-coumaroyl)-gl
ucopyranoside [46], và axit phenolic [43, 47].
Hình 1.6. Các hợp chất khác từ loài Thạch tùng răng cưa [1].
A. Serrat-14-en-3β,21α,29-triol; B. 5,5’-dihydroxy-2’,4’dimethoxyflavone-7-О-β-D-(6’’-O-Z-p-coumaroyl)-glucopyranoside.
Năm 2019, Lê Đình Mạnh và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được hai hợp
chất terpenoid từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của cây Thạch tùng răng cưa
bằng phương pháp sắc ký cột và sắc kí lớp mỏng. Hai hợp chất phân lập được có tên
là 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axit-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat)
(HSE-1); 16-oxo-3α-hydroxyserrat-14-en-21β-ol (HSE-2) (Hình 1.7). Trong đó, lần
đầu
tiên
hợp
chất
3β,
21β,
29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic
axit-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa [48].
Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b) [48].
