Luận văn thạc sĩ xác định giá trị sử dụng của các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật ứng dụng trong kiểm nghiệm thịt đông lạnh nhập khẩu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ HẰNG

XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÁC PHƯƠNG
PHÁP XÉT NGHIỆM VI SINH VẬT ỨNG DỤNG TRONG
KIỂM NGHIỆM THỊT ĐÔNG LẠNH NHẬP KHẨU

Chuyên ngành:

Thú y

Mã số:

60 64 01 01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Hồng Ngân

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠO HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các
kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách
quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được
cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hằng

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn,
tơi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo,
sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới PGS. TS Phạm Hồng Ngân đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức,
thời gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám Đốc, Ban quản lý đào
tạo, Bộ môn Thú y Cộng đồng, Khoa Thú y- Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã tận
tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể ban lãnh đạo, cán bộ viên chức cơ quan
Thú y vùng 2 đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên
khuyến khích tơi hồn thành luận văn.
Hà Nội, ngày

tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hằng

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan........................................................................................................................... i
Lời cảm ơn.............................................................................................................................. ii
Mục lục..................................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt....................................................................................................... vi
Danh mục bảng................................................................................................................... vii
Danh mục hình................................................................................................................... viii
Trích yếu luận văn............................................................................................................... ix
Thesis abstract..................................................................................................................... xi
Phần 1. Mở đầu...................................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài..................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................ 2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu............................................................................................. 2

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài..................................................2

Phần 2. Tổng quan tài liệu................................................................................................ 3

2.1.

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp.............................................3

2.1.1.

Một số khái niệm................................................................................................... 3

2.1.2.

Các thông số kỹ thuật trong thẩm định, xác nhận giá trị sử dụng của

phương pháp......................................................................................................... 4
2.2.

Một số cách tiếp cận để xác định giá trị sử dụng của phương pháp từ các

tổ chức có uy tín.................................................................................................. 6
2.3.

Luật an toàn thực phẩm và các quy phạm pháp luật qui định giới hạn

mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong thịt, sản phẩm thịt.........................8
2.3.1.

Trên thế giới............................................................................................................ 8

2.3.2.

Tại Việt Nam........................................................................................................... 11

2.4.

Hệ vi sinh vật gây mất vệ sinh, an toàn trong thịt và các sản phẩm thịt
12

2.4.1.

Tổng số Vi sinh vật hiếu khí........................................................................... 12

2.4.2.

E.coli......................................................................................................................... 13

2.4.3.

Salmonella............................................................................................................. 14

2.5.

Ngộ độc thức ăn do thịt nhiễm khuẩn....................................................... 15

2.5.1.

Ngộ độc và nhiễm bệnh do vi khuẩn.........................................................15

iii


2.5.2.

Ngộ độc do độc tính của vi khuẩn..............................................................17

2.6.

Các phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thịt và sản phẩm thịt
18

2.6.1.

Một số phương pháp định lượng tổng số VSVHK..............................18

2.6.2.

Một số phương pháp định lượng E.coli................................................... 19

2.6.3.

Phương pháp phát hiện Salmonella.......................................................... 20

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu...................................................... 21
3.1.

Đối tượng, địa điểm nghiên cứu.................................................................21

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu......................................................................................21

3.1.2.

Địa điểm nghiên cứu......................................................................................... 21

3.2.

Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 21

3.2.1.

Xác định giá trị sử dụng của phương pháp...........................................21

3.2.2.

Ứng dụng Kiểm nghiệm một số mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu...21

3.3.

Nguyên liệu............................................................................................................ 21

3.3.1.

Chủng chuẩn vi sinh vật.................................................................................. 21

3.3.2.

Các mâũ thịt đông lạnh:.................................................................................. 22

3.3.3.

Các thiết bị trong phịng thí nghiệm..........................................................23

3.3.4.

Mơi trường chính ni cấy vi sinh vật...................................................... 22

3.4.

Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 23

3.4.1.

Phương pháp thẩm định tiêu chuẩn.......................................................... 23

3.4.2.

Phương pháp kiểm nghiệm một số chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt
27

3.4.3.

Phương pháp phân tích số liệu.................................................................... 27

Phần 4. Kết quả và thảo luận........................................................................................30
4.1.

Kết quả thẩm định phương pháp................................................................30

4.1.1.

Kết quả đánh giá hiệu suất môi trường sử dụng trong thẩm định phương pháp

30

4.1.2.

Kết quả kiểm tra nền mẫu đánh giá...........................................................30

4.1.3.

Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa, đặc tính nuôi cấy của chủng chuẩn
31

4.1.4.

Kết quả xác định nồng độ vi khuẩn gây nhiễm....................................34

4.1.5.

Kết quả thẩm định TCVN 9977:2013..........................................................35

4.1.6.

Kết quả thẩm định TCVN 9975: 2013.........................................................38

4.1.7.

Kết quả xác nhận giá trị sử dụng của TCCS 03: 2016/TYV2-CĐ...39

4.2.

Kết quả kiểm nghiệm một số mẫu thịt đông lạnh nhập khẩu.........44

4.2.1.

Kết quả kiểm nghiệm mẫu thịt bị đơng lạnh.........................................46


iv


4.2.2.

Kết quả kiểm nghiệm mẫu đùi gà................................................................47

4.2.3.

Kết quả kiểm nghiệm trên mẫu thịt gà nguyên con............................47

Phần 5. Kết luận và kiến nghị.......................................................................................50
5.1.

Kết luận.................................................................................................................... 50

5.2.

Kiến nghị................................................................................................................ 51

Tài liệu tham khảo.............................................................................................................. 52
Phụ lục.................................................................................................................................... 57

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Nghĩa tiếng Việt

Chữ viết tắt
AOAC (Association of Official Analytical Chemists)

: Hiệp hội phân tích hố phân tích

chính thức
ATCC (American Type Culture Collection)

: Hệ thống chủng chuẩn của Hoa Kỳ

ATTP

: An toàn thực phẩm

BYT

:BộYTế

CFU (Colony Forming Unit)

: Đơn vị hình thành khuẩn lạc

E. coli

: Escherichia coli

FAO (Food and Agriculture Organization of the

: Tổ chức nông lương quốc tế

United Nations)
FDA (The United States Food and Drug Administration)

: Cục Thực phẩm và Dược Hoa Kỳ

HACCP(Hazard Analysis and Critical Control Point)

: Phân tích mối nguy và điểm kiểm

sốt tới hạn
ICH (International Conference for Harmonization)

: Hội thảo quốc tế về đồng bộ hố

ISO (International Organization for Standarlization)

:Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế

KĐBĐ

: Không đảm bảo đo

LOD ( Limit of Detection)

: Giới hạn phát hiện

NMKL (Nordisk metodikkomite for levnedsmidler)

: Ủy ban phân tích thực phẩm Bắc Âu

OIE (World Organisation for Animal Health)

: Tổ chức Thú y thế giới

QCVN

: Quy chuẩn Việt Nam

TCCS

: Tiêu chuẩn cơ sở

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

TPP (Trans-Pacific Partnership Agreement)

: Hiệp định đối tác xuyên
Thái Bình Dương

TSVSVHK

: Tổng số vi sinh vật hiếu khí

WHO (World Health Organization)

: Tổ chức Y tế thế giới

VSATTP

: Vệ sinh an toàn thực phẩm

WTO (World Trade Organization)

: Tổ chức thương mại thế giới.

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Qui định chung của Châu âu (EC) số 2073/2005 về tiêu chuẩn vi sinh đối
thịt và sản phẩm thịt.................................................................................... 10
Bảng 2.2. Giới hạn vi sinh vật trong thịt và sản phẩm thịt theo QCVN 8-3/BYT 11
Bảng 3.1. Mơi trường chính dùng để thẩm định phương pháp và phân tích các chỉ tiêu
VSV

22

Bảng 4.1. Kết quả đánh giá hiệu suất môi trường.............................................. 30
Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm nền mẫu đánh giá................................................ 31
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra, so sánh đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ........32
Bảng 4.4. Kết quả dò nồng độ vi khuẩn E.coli, Salmonella............................ 34
Bảng 4.5. Kết quả độ lặp lại, độ tái lặp TCVN 9977:2013, TCVN 4884-2:2015....35
Bảng 4.6. Kết quả tính độ không đảm bảo đo TCVN 9977:2013...................37

Bảng 4.7. Kết quả độ lặp lại, độ tái lặp TCVN 9975:2013, TCVN 7429-2:2008....38
Bảng 4.8. Kết quả xác định độ không đảm bảo đo TCVN 9975:2013.........39
Bảng 4.9. Kết quả xác định nồng độ gây nhiễm.................................................. 40
Bảng 4.10. Kết quả Tỉ lệ Salmonella dương tính................................................. 41
Bảng 4.11. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp...........41
Bảng 4.12. Kết quả phát hiện Salmonella............................................................... 42
Bảng 4.13. Kết quả so sánh sự tương đồng TCCS03:2016; TCVN 4884:2005.....43

Bảng 4.14. Kết quả thực hiện thử nghiệm thành thạo...................................... 44

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên các mơi trường chọn lọc đặc trưng ...34
Hình 4.2. Tỉ lệ % các lơ mẫu kiểm nghiệm,............................................................ 45
Hình 4.3. Kết quả định lượng tổng số VSVHK trong các mẫu thịt bò .......46
Hình 4.4. Kết quả định lượng tổng số VSVHK trong các lơ mẫu đùi gà. .47
Hình 4.5. Kết quả định lượng tổng số VSVHK trong các lơ gà ngun con......48
Hình 4.6. Tỉ lệ nhiễm tổng số VSVHK trên các mẫu kiểm nghiệm..............49

viii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Nguyễn Thị Hằng
Tên luận văn: “ Xác định giá trị sử dụng của các phương pháp xét nghiệm vi
sinh vật ứng dụng trong kiểm nghiệm thịt đông lạnh nhập khẩu”.

Ngành: Thú Y

Mã số: 60 64 01 01

Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
- Đảm bảo các kết quả thử nghiệm
- Cung cấp số liệu cho hoạt động đánh giá công nhận phép thử.
- Ứng dụng kiểm nghiệm, xét nghiệm mẫu thịt đông lạnh.

Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp thẩm định
Thẩm định phương pháp theo Trần Cao Sơn 2010, Tiêu chuẩn Việt
nam 9332:2012.
Phương pháp kiểm nghiệm mẫu thịt
+ Định lượng tổng số VSVHK theo TCVN 9977:2013
+ Định lượng E.coli theo TCVN 9975:2013
+ Định tính Salmonella theo TCCS 03-2016/TYV2-CĐ

Kết quả chính và kết luận
Kết quả thẩm định phương pháp định lượng Tổng số VSVHK theo TCVN
9977:2013: Các thông số: Độ lặp lại Sr: có giá trị 0,045-0,047 , Độ tái lặp S R có
giá trị 0,033-0,038, giá trị độ khơng đảm bảo đo của phương pháp Ue : 0,126.
Kết quả thẩm định phương pháp định lượng E.coli theo TCVN 9975: 2013
Các thông số đạt được độ lặp lại Sr nằm trong khoảng 0,029-0,033, Độ tái lặp S R có
giá trị 0,032- 0,039, giá trị độ không đảm bảo đo của phương pháp Ue: 0,098.

Kết quả xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phát hiên
Salmonella :các thông số giới hạn phát hiện LOD: 2CFU/25g, độ nhạy
Se: 95,56%, độ đặc hiệu Sp: 100%, độ chính xác Ac: 97,33%).
Kết quả kiểm nghiệm mẫu thịt

94 lơ (470) mẫu thịt bị, 64 lơ (320 mẫu) thịt đùi gà, 15 lô (75 mẫu) thịt gà nguyên
con đông lạnh nhập khẩu được xét nghiệm 3 chỉ tiêu Tổng số vi sinh vật hiếu

ix


khí, E.coli, Salmonela. 100% mẫu đạt vệ sinh ATTP, khơng phát hiện Salmonella và
E.coli trong các mẫu xét nghiệm, tổng số VSVHK nằm trong giới hạn cho phép.

Kết luận
Độ lặp lại, độ tái lặp và độ không đảm bảo đo ở phương pháp thay thế TCVN
9977:2013 và TCVN 9975:2013 có giá trị nhỏ hơn so với phương pháp tham chiếu.

Phương pháp thay thế định tính salmonella theo TCCS
03:2016/TYV2 hồn tồn tương đồng với TCVN4829:2005.
100% mẫu đạt vệ sinh ATTP, các mẫu xét nghiệm không phát hiện
Salmonella và E.coli, tổng số VSVHK nằm trong giới hạn cho phép.

x


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Nguyen Thi Hang
Thesis title: “Validation of microbiological methods, used for testing
imported frozen meat samples”
Major: Veterinary

Code: 60.64.01.01

Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

1. Research Objective: The objective of the studying is the requirement to ensure
laboratory test results, Provide an in-service staff for the laboratory's conformity
assessment accreditation. Use approved methods to test imported frozen meats.

Meterial and Methods:

2.

Meterial: The studying use some positive bacterial from
American Type Culture Collection:
-

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis ATCC®

49223™*,
-

Escherichia coli ATCC® 11303™
®

TM

-

Vibrio parahaemolyticus ATCC . 17802

-

Staphylococus aureus subsp aureus ATCC . 29213

Samples fzoren meat export: Beefs and chickens.

®

TM

- Validation method accoding to Tran Cao Son 2010.
- Vietnam Standard 9332: 2012

Testing methods for meat samples
- Enumeration of aerobic plate count using Petrifilm
according to TCVN 9977: 2013
- Enumeration of Escherichia coli using Petrifilm
according to TCVN 9975: 2013

TM

TM

count plate

count plate

- Detection Salmonela spp according to TCCS 03-2016 / TYV2-CĐ
3. Main findings
The results of validation method Enumeration of aerobic plate count using

Petrifilm

TM

count
plate TCVN 9977: 2013:
Repeatability
Sr:
0,045-0,047,
Reproducibility SR : 0,033-0,038, expanded uncertainty value Ue: 0,126.
The results of validation omethod Enumeration of Escherichia coli using
Petrifilm

TM

count plate accoding TCVN 9975: 2013: Repeatability Sr 0,029-0,033,

xi


Reproducibility SR is 0,032-0,039, expanded uncertainty value Ue : 0,098.
The results of validation method for detection of Salmonella using
Iris Salmonella agar
: The assay procedure with artificially contaminated samples was able to detect
as low as 2 CFU Salmonella/25 g of food samples (beef and chicken meats): Detection
Limit: 2CFU / 25g,, Specificity : 100%, Sensitivity: 93,35%, Accuracy: 97,33%.

100% of hygiene samples, none of samples found with Salmonella and E.coli,
the total number of Aerobic microorganisms is within the allowable limits.

Conclusions
Repeatability, reproducibility, measurement uncertainty of
alternative methods are smaller than repeatability, reproducibility,

measurement uncertainty of reference methods.
The alternation method detection Salmonella accoding to TCCS
03:2016/TYV2-CD is as similar as TCVN 4829:2005.
100% of hygienic hygiene samples, none of samples found with Salmonella and
E.coli, the total number of Aerobic microorganisms is within the allowable limits.

xii


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong bối cảnh hiện nay, khi giao thương quốc tế ngày càng phát triển,
Việt Nam kí kết các hiệp định thương mại với nhiều quốc gia trên thế giới và
trong khu vực, đặc biệt sự tham gia vào tổ chức thương mại thế giới (WTO) và
hiệp định thương mại tự do TPP, hàng rào thuế quan ngày càng giảm. Bên cạnh
những lợi ích nhận được là thách thức lớn đối với nền kinh tế nói chung và
ngành nơng nghiệp nói riêng. Mở cửa với thế giới đồng nghĩa với hàng hóa từ
nhiều quốc gia thâm nhập vào thị trường trong nước ngày càng nhiều, sự tuân
thủ các điều khoản trong hiệp định khơng cho phép cấm nhập khẩu hàng hóa
từ các quốc gia khác trừ khi có những chứng cứ khoa học chứng minh rằng
sản phẩm đó gây mất an tồn cho người sử dụng. Đối với thực phẩm, việc phát
triển các phương pháp xét nghiệm mới phù hợp hoặc tương đương với các
phương pháp, tiêu chuẩn chung của thế giới là cần thiết vì đây là rào cản kỹ
thuật hợp pháp, là công cụ pháp lý để bảo vệ người tiêu dùng, hạn chế được
những mặt hàng kém chất lượng, khơng an tồn thâm nhập vào nước ta.
Xây dựng và phát triển các phương pháp xét nghiệm trong lĩnh vực sinh
học (vi sinh thực phẩm) là việc làm cần thiết nhằm đáp ứng yêu cầu pháp luật
trong lĩnh vực an toàn thực phẩm (ATTP), cụ thể theo yêu cầu của ISO 17025:
2005 và theo nghị định 132/2008/NĐ-CP quy định chi tiết thi hành một số điều
của luật chất lượng sản phẩm, hàng hóa. Đối với các hàng hóa nhập khẩu phải

đảm bảo an toàn cho người sử dụng. Trong lĩnh vực nông nghiệp, thông tư
54/2011/TT-BNNPTNT quy định các yêu cầu về năng lực cho các phịng thử
nghiệm có khả năng phân tích các phép thử thuộc lĩnh vực sinh học, hóa học
phục vụ cho cơng tác quản lý nhà nước về chất lượng an toàn thực phẩm. Dựa
trên cơ sở vật chất sẵn có, việc lựa chọn một phương pháp phân tích, xét
nghiệm phù hợp sẽ quyết định chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích.

Các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật hiện nay ở Việt Nam
ngoài Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN), cịn có hệ thống các phương pháp
theo tiêu chuẩn quốc tế: Các phương pháp của tổ chức Tiêu chuấn hóa
quốc tế (ISO), hiệp hội phân tích hóa học quốc tế (AOAC), hệ thống các
phương pháp theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia ngồi ra cịn các
phương pháp cơ sở do phịng thí nghiệm tự xây dựng (TCCS).

1


Đối với các phương pháp mới lần đầu áp dụng, các phương pháp cơ sở do
phịng thí nghiệm xây dựng cần phải tuân thủ việc đánh giá, thẩm định phương
pháp thực hiện tại phịng thí nghiệm đồng thời phải nhận được sự công nhận từ
các tổ chức đánh giá công nhận trước khi ứng dụng vào công tác xét nghiệm.
Năm 2016, phịng thí nghiệm vi sinh thực phẩm thuộc Trạm chẩn đoán xét
nghiệm – Cơ quan thú y Vùng 2 xây dựng và ứng dụng mở rộng thêm nhiều
phương pháp xét nghiệm mới vào cơng tác chẩn đốn cũng như công tác kiểm
nghiệm thực phẩm. Với lượng mẫu thực phẩm nhập khẩu ngày càng nhiều, vấn đề
đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm đặt ra yêu cầu, thách thức trong công tác kiểm
dịch. Trước sức ép phải đảm bảo thời gian trong công tác kiểm dịch, thời gian trả
lời kết quả cho khách hàng, việc ưu tiên phát triển, ứng dụng các phương pháp
mới với tiêu chí: Đảm bảo độ chính xác, tin cậy của kết quả thử nghiệm, rút ngắn
được thời gian xét nghiệm, góp phần bảo vệ mơi trường và đặc biệt là giảm chi phí

cho các doanh nghiệp được đặt lên hàng đầu. Với những lí do nêu trên, tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Xác định giá trị sử dụng của các phương pháp xét nghiệm
vi sinh vật ứng dụng trong kiểm nghiệm thịt đông lạnh nhập khẩu”.

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện nhằm đáp ứng các yêu cầu trong việc
đảm bảo các kết quả thử nghiệm, cũng như đáp ứng được yêu cầu kỹ
thuật trong hoạt động đánh giá công nhận phép thử. Ứng dụng được
vào công tác kiểm nghiệm, xét nghiệm mẫu thịt đông lạnh.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Xác định giá trị sử dụng của các phương pháp và ứng dụng kiểm nghiệm các

vi sinh vật gây ô nhiễm thịt và sản phẩm thịt quy định trong QCVN 8-3: 2012/BYT
được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 8/2016 đến tháng 6/2017, tại phịng

vi sinh thực phẩm- Trạm chẩn đốn xét nghiện- Cơ quan Thú y vùng 2.

1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Ý nghĩa khoa học của đề tài: Đây là nguồn tài liệu tham khảo

phục vụ cho các nghiên cứu đánh giá, thẩm định phương pháp.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: là cơ sở khoa học để đưa các

phương pháp mới, ứng dụng trong hoạt động kiểm nghiệm. Rút ngắn
thời gian xét nghiệm mẫu phục vụ tốt trong công tác kiểm dịch, giúp
cho việc thơng quan hàng hóa được xúc tiến nhanh hơn.

2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP
2.1.1. Một số khái niệm
Thẩm định phương pháp hay xác nhận giá trị sử dụng của phương
pháp: là sự khẳng định bằng việc kiểm tra, cung cấp bằng chứng khách
quan chứng minh phương pháp đó đáp ứng yêu cầu đặt ra. Kết quả của
thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ
tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm đinh phương pháp phân tích là một
phần khơng thể thiếu nếu muốn có kết quả nghiên cứu đáng tin cậy.
Hiện nay nhiều thuật ngữ khác nhau được sử dụng để chỉ khái niệm trên
như: Định trị phương pháp, đánh giá phương pháp, xác nhận giá trị sử dụng
của phương pháp, phê duyệt phương pháp. Tất cả các thuật ngữ này đều là
cách gọi khác nhau của thẩm định phương pháp (Trần Cao Sơn và cs., 2010).

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (đánh giá phương pháp
thay thế): là quá trình thực nghiệm để chứng minh kết quả phân tích nhận
được từ phương pháp thay thế là tương đương hay vượt trội so với kết quả
nhận được từ phương pháp tham chiếu (phương pháp tiêu chuẩn).

Phương pháp thay thế (alternation method): là phương pháp
mới hay những phương pháp cải tiến từ những phương pháp tiêu
chuẩn mà khi tiến hành sẽ cho kết quả tương đương với khi thực
hiện bằng phương pháp tiêu chuẩn trên cùng một đối tượng mẫu.
Phương pháp tham chiếu (reference method): là phương pháp
tiêu chuẩn được công nhận ở cấp quốc gia hay quốc tế (Ví dụ: NMKL,
ISO, CEN, AOAC và các tiêu chuẩn quốc gia).
Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong hoạt
động kiểm nghiệm mẫu, dựa vào nguồn gốc phương pháp có thể thành hai nhóm:

Nhóm phương pháp tiêu chuẩn: phương pháp theo tiêu chuẩn

quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên
thế giới như: ISO, AOAC, TCVN…
Các phương pháp không tiêu chuẩn: phương pháp do phòng thử nghiệm

3


xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sán xuất thiết bị,
phương pháp theo tạp chí, tài liệu chuyên ngành.
Theo ISO 17052 các phương pháp trước khi đưa vào sử dụng cần
phải được thẩm định (ISO 17025:2005). Tùy thuộc vào điều kiện vào điều
kiện phịng thí nghiệm, mục đích, tính chất, đặc điểm cũng như lĩnh vực
hoạt động, nghiên cứu mà lựa chọn các kiểu thẩm định phù hợp.

Trong thẩm định phương pháp, hiện nay có bốn loại thẩm định
đang được áp dụng:
- Loại 1: Thẩm định trước khi đưa vào sử dụng (Prospective validation)
- Loại 2: Thẩm định hồi cứu (Retrospective validation)
- Loại 3: Thầm định đồng thời (Concurrent validation)
- Loại 4: Thẩm định lại (Revalidation)
2.1.2. Các thông số kỹ thuật cần xác định trong thẩm định phương pháp

Đối với phương pháp định lượng: theo tác giả Trần Cao Sơn và cs
( 2010) cần lựa chọn các thông số: Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng,
độ lặp lại và độ tái lặp. Theo thông tư 54/2011/TT-BNNPTNT hướng dẫn thực
hiện tại các phòng thử nghiệm quan tâm đến các thông số: Độ lặp lại, độ tái
lặp, độ không đảm bảo đo, độ nhạy, độ đúng (BNNPTNT, 2011).

Độ lặp lại (Sr): được tính là sự thay đổi của kết quả đo trên
cùng một mẫu thử trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại thể hiện sự

sai khác về kết quả đo trong điều kiện các thông số thực hiện
phương pháp là cố định: hoá chất, thiết bị, mẫu thử, người phân tích.
Giới hạn lặp lại: Giá trị mà độ lệnh tuyệt đối giữa hai kết quả
nhận được trong điều kiện lặp lại nhỏ hơn hoặc bằng giá trị đó với
xác suất bằng 95% (TCVN 6910-1, 2001). Theo Nguyễn Tiến Dũng
(2016), giá trị Sr phải nhỏ hơn 0,15 là được chấp nhận.
Độ tái lặp (SR): được tính là sự thay đổi của kết quả đo trên cùng một mẫu
thử trong khoảng thời gian dài. Độ tái lặp thể hiện sự sai khác về kết quả đo khi
cùng một mẫu thử được phân tích bởi cùng một phương pháp nhưng do 2 phịng
thí nghiệm tiến hành độc lập (so sánh liên phịng). Tuy nhiên, trong q trình áp
dụng, để giảm bớt chi phí phân tích cho so sánh liên phịng, có thể tiến hành xác
định độ tái lặp trung gian (hay còn gọi là độ tái lặp nội bộ) khi dùng cùng một

4


mẫu thử trong khoảng thời gian phân tích kéo dài, cùng một phương pháp nhưng
do các kiểm nghiệm viên khác nhau thực hiện song song. Kết quả đo được tổng
hợp và xử lý thống kê để tính tốn độ tái lặp trung gian tương tự với độ tái lặp.

Giới hạn tái lặp: Giá trị mà độ lệch tuyệt đối giữa hai kết quả
nhận được trong điều kiện tái lặp nhỏ hơn hoặc bằng giá trị đó với
xác suất bằng 95% (TCVN 9610-1, 2001), Giá trị S R được chấp nhận
khi nhỏ hơn hoặc bằng 0,25 (Nguyễn Tiến Dũng, 2016).
Độ không đảm bảo đo mở rộng (U): Đại lượng xác định một
khoảng bao quanh kết quả của phép đo mong muốn sẽ chứa phần lớn
phân bố của các giá trị có thể quy một cách hợp lí cho đại lượng đo.
Độ không đảm bảo mở rộng U (được định nghĩa bởi GUM) có được từ độ
khơng đảm bảo đo chuẩn tổng hợp uc(y) với hệ số phủ k được chọn trong tiêu
chuẩn là 2 (tương đương với độ tin cậy xấp xỉ 95 %): U = 2uc(y) (TCVN 9332, 2012).

Đối với phương pháp định tính: Theo tác giả Trần Cao Sơn, các
thông số cần lựa chọn để thẩm định gồm: Giới hạn phát hiện, độ đặc
hiệu, độ nhạy, độ lệch dương, độ lệch âm và độ chính xác.
Giới hạn phát hiện (LOD): là mật độ tế bào vi sinh vật thấp nhất mà một
phương pháp phân tích có thể phát hiện được. Tại giới hạn phát hiện, số lần phân
tích cho kết quả dương tính phải trên 50%. Việc xác nhận hiệu lực phải chứng minh
được rằng phương pháp thay thế có giới hạn phát hiện bằng hoặc thấp hơn giới
hạn phát hiện của phương pháp tham chiếu. Theo qui định của tiêu chuẩn AOAC,
giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chọn ở các cấp độ
khác nhau. Thấp nhất là 1 - 5 tế bào/25g mẫu, cao nhất là l0 - 50 tế bào/25g mẫu
thực phẩm. Theo tiêu chuẩn của NorđVal (Đan Mạch), giới hạn này được khảo sát ở
các cấp độ là: 0,1 - 10, 10 - 100 tế bào/25g mẫu thực phẩm.

Độ nhạy (Se): là tỉ lệ của các vi sinh vật đích có thể được phát hiện.

Độ đặc hiệu (Sp): là khả năng phân biệt vi sinh vật đích với các
vi sinh vật khác.
Độ lệch dương: là xác suất chẩn đoán, phát hiện sai ở các
trường hợp cho kết quả dương tính.
Độ lệch âm: là xác suất chẩn đốn, phát hiện sai ở các trường
hợp cho kết quả âm tính.

5


Độ chính xác (AC): chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của
kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng, hay
là mức độ giống nhau giữa kết quả phân tích được với kết quả tham chiếu.

2.2. MỘT SỐ CÁCH TIẾP CẬN ĐỂ XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA
PHƯƠNG PHÁP TỪ CÁC TỔ CHỨC CĨ UY TÍN
Có rất nhiều cách tiếp cận để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp,
các cách tiếp cận đều giống nhau ở cách nhận diện thông số cần đánh giá nhưng
khác nhau cơ bản ở cách tính tốn và tiêu chí chấp nhận cho các thơng số đó.

- Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (The United States
Food and Drug Administration – FDA) là cơ quan đảm bảo an toàn thực phẩm
và dược phẩm của Hoa Kỳ, FDA đã xây dựng hai bộ tài liệu “Guidance for
Industry Bioanalytical Method Validation -Hướng dẫn cho việc thẩm định
phương pháp phân tích và thẩm định phương pháp phân tích sinh học. Cuốn
tài liệu này được FDA xây dựng dựa trên các tài liệu nghiên cứu được trình bày
trong các hội thảo từ năm 1990 đến năm 2008 do vậy đây là tài liệu hướng dẫn
thẩm định phương pháp trong nhiều lĩnh vực.(Fda, 2013).

- Hiệp hội phân tích hố học (Association of Official Analytical Chemists
– AOAC) được thành lập từ năm 1884 với tên hiệp hội các nhà hóa học nơng
nghiệp (Association of Official Agricultural Chemists), năm 1965 đổi tên thành
Hiệp hội các nhà phân tích hóa học (Association of Official Analytica Chemists),
đến năm 1991 tên được thay đổi thành AOAC International và giữ cho đến nay.
Việc đổi tên để phản ánh phạm vi quốc tế về công việc của tổ chức và thành
viên quốc tế của nó, bao gồm 16 khu vực trên thế giới với hơn 3000 thành viên,
1/3 số thành viên nằm ngoài nước Mỹ.

Hoạt động của AOAC mở rộng ra lĩnh vực sinh học khơng cịn gói
gọn ở lĩnh vực khóa học. Các ấn phẩm của AOAC tập chung vào các
phương pháp phân tích tồn diện. AOAC đã xuất bản một tài liệu kỹ thuật
cho việc phê duyệt phương pháp phân tích phù hợp với yêu cầu của Tiêu
chuẩn ISO 17025. “AOAC International Methods Committee Guidelines for
Validation of Microbiological Methods for Food and Environmental

Surfaces” Đây là tài liệu hướng dẫn chi tiết các bước và cách thức thực
hiện được tiến hành trong thẩm định, phê duyệt phương pháp (Aoac, 2012).

6


- Tổ chức Thú y thế giới (OIE ) được thành lập vào năm 1924 theo một
thỏa thuận quốc tế giữa 28 quốc gia thành viên. Tổ chức này hiện có đến 167
nước thành viên, mục tiêu của tổ chức này nhằm vào việc bảo đảm sự minh
bạch trên phạm vi toàn cầu về bệnh dịch và hiện trạng bệnh dịch trên động vật,
công bố các tiêu chuẩn vệ sinh trong buôn bán động vật và sản phẩm động vật,
tăng cường các kỹ năng thú y, cải thiện an toàn thực phẩm có nguồn gốc động
vật và tăng cường trong bảo vệ động vật trên cơ sở khoa học.

Các tiêu chuẩn, hướng dẫn và khuyến nghị của OIE được ghi trong
Luật về Sức khỏe Động vật trên cạn, Cẩm nang Xét nghiệm Chẩn đốn và
Tiêm phịng Vắc xin với Động vật trên cạn, Luật về Sức khỏe Động vật dưới
nước và Cẩm nang Xét nghiệm Chẩn đoán với động vật dưới nước.

Năm 2013 OIE đã thông qua bản hướng dẫn nguyên tắc thẩm định
cho phương pháp chẩn đoán “Principles and methods of validation of
diagnostic assays for infectious diseases”. Ở tài liệu này, OIE hướng
dẫn chi tiết cách lựa chọn thông số và thực hiện đánh giá các thông số
thẩm định cho các phương pháp nghiên cứu chẩn đoán. (OIE, 2013).
Ủy ban Tiêu chuẩn thực phẩm Codex(‘Luật về thực phẩm’) là đầu mối
trong Chương trình Tiêu chuẩn về Thực phẩm chung giữa Tổ Chức Nông
Lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO). Codex xây dựng và
khuyến khích việc thực thi những tiêu chuẩn, cách thức thực hiện, hướng dẫn
và các khuyến nghị chung cho mọi khía cạnh về an tồn thực phẩm, kể cả quy
trình xử lý và phân phối. Trong việc xây dựng các tiêu chuẩn quốc tế về thực

phẩm, Codex với 2 nhiệm vụ là bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và bảo đảm
sự công bằng trong hoạt động thương mại thực phẩm. Codex đã xây dựng
nhiều qui định cụ thể ở phạm vi rộng bao trùm nhiều khía cạnh về an tồn và
chất lượng thực phẩm. Tuy không ban hành các tiêu chuẩn hay tài liệu hướng
dẫn việc thẩm định các phương pháp nhưng các tiêu chuẩn được Codex xây
dựng được thẩm định bởi các tổ chức uy tín khác: AOAC, FAO…,

- Ủy ban phân tích thực phẩm bắc Âu (NMKL), được thành lập từ năm
1947 bao gồm các nhà hóa học, vi sinh vật học, phân tích và đánh giá cảm quan
và thống kê từ 5 quốc gia Bắc Âu, Đan Mạch, Phần Lan, Iceland, Na Uy và Thụy
Điển. NMKL hoạt động trong nhiều lĩnh vực: tổ chức kiểm tra và chứng nhận

7


các phương pháp độc quyền, phát triểm phương pháp, xây dựng hệ
thống đánh giá phương pháp sinh học thay thế. Hướng dẫn thẩm định
phương pháp xây dựng tương đương với Iso 16140: 2003 (NMKL, 2009).
- Hiệp hội hoá học Châu Âu (EURACHEM) đã xuất bản một hướng

dẫn chi tiết để xác nhận phương pháp. Đây là hướng dẫn chính thức chi
tiết nhất cho lý thuyết và thực tiễn của việc xác nhận phương pháp đã
được phát triển chủ yếu cho tiêu chuẩn ISO/IEC về việc cơng nhận
phịng thí nghiệm. Bản hướng dẫn này khá đầy đủ và được ứng dụng tốt
cho các phịng thí nghiệm về sinh học và dược phẩm.
- ISO ( International Organization for Standarlization: viết tắt là ISO): Tổ
chức tiêu chuẩn hóa quốc tế, là cơ quan thiết lập tiêu chuẩn quốc tế bao gồm
các đại diện từ các tổ chức tiêu chuẩn các quốc gia.Tổ chức này đã đưa ra các
tiêu chuẩn thương mại và công nghiệp trên phạm vi toàn thế giới.

ISO được thành lập từ năm 1946, chính thức hoạt động vào ngày 23
tháng 2 năm 1947. Thành viên của ISO gồm: Thành viên đầy đủ, thành viên
thông tấn và thành viên đăng ký. Thành viên của ISO phải là cơ quan tiêu
chuẩn hóa quốc gia, đến nay ISO đã có 162 thành viên. Các hoạt động kỹ
thuật của ISO được triển khai bởi 2959 cơ quan kỹ thuật. Cho đến nay ISO
xuất bản được 21579 tiêu chuẩn quốc tế, về hướng dẫn thẩm định phương
pháp ISO đã ban hành tiêu chuẩn số 16140: 2003 hướng dẫn cách thức để
xác nhận phương pháp thay thế ( ISO 16140, 2003).

Việt nam (Đại diện là tổng cục Tiêu chuẩn đo lường Chất lượng)
tham gia ISO từ năm 1977 và đã có những đóng góp nhất định cho tổ
chức này. Cho đến nay có khoảng 1380 tiêu chuẩn ISO được chấp
nhận thành Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN).
2.3. LUẬT AN TOÀN THỰC PHẨM VÀ CÁC QUY PHẠM PHÁP LUẬT
QUI ĐỊNH GIỚI HẠN MỨC ĐỘ Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỊT,
SẢN PHẨM THỊT
2.3.1. Trên thế giới
Sự tăng sinh của vi sinh vật trong thịt dẫn đến sự biến đổi chất lượng, 10 6 tế
bào/g(ml) là ranh giới phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay khơng. Một vài
trường hợp 106 tế bào thực phẩm chưa có dấu hiện hư hỏng rõ ràng về

8


8

mặt hóa học. 10 tế bào tất cả các loại thực phẩm có mùi hơi, từ 10
10
đến 10 thực phẩm thay đổi cấu trúc (Lương Đức Phẩm, 2002).

9

Xuất phát từ tầm quan trọng của thực phẩm đối với cộng đồng rất
lớn, thực phẩm ni sống con người đồng thời nó cũng là nguồn dinh
dưỡng cần thiết cho các vi sinh vật . Việc quan tâm phát triển sản xuất tạo
ra nguồn thực phẩm đảm bảo an toàn là nhu cầu hàng ngày là cấp thiết và
chính đáng. Các quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm đến vấn đề đảm
bảo an tồn thực phẩm cho người tiêu dùng. Chính vì vậy mà luật An tồn
thực phẩm với những quy định cụ thể để quản lý thực phẩm ở nhiều cấp độ
khác nhau được ban hành ở nhiều quốc qia và vùng lãnh thổ trên thế giới.
Tại Cộng hòa liên bang Đức: Luật về sự lưu hành thực phẩm được ban
hành từ năm 1974. Đây là bộ luật về thực phẩm rất đầy đủ thể hiện nhiều khía
cạnh từ lưu thơng trong nước đến xuất nhập khẩu, trong đó tất cả các vấn đề
liên quan đến thực phẩm đều được đề cập. Các tiêu chuẩn về thực phẩm được
thể hiện thành luật rất chi tiết, từ giới hạn các vitamin, muối khoáng, vi sinh vật,
ký sinh trùng đến tiêu chuẩn các đồ bao gói, chứa đựng.

Nhật Bản: Luật An Tồn thực phẩm ra đời năm1974 và được sửa đổi
hoàn thiện năm 2006 được quy định chặt chẽ, ban hành nhiều tiêu chuẩn cụ
thể: Tiêu chuẩn về thực phẩm, quy định rõ việc cấm bán các loại thịt bị
bệnh, ban hành tiêu chuẩn phịng chống ơ nhiễm thực phẩm, trực tiếp
chứng nhận HACCP cho 6 ngành thực phẩm có nguy cơ cao trong đó có
ngành chế biến thịt và sản phẩm thịt.(Food sanitation low in Japen, 2006).

Australia: ban hành luật thực phẩm tinh khiết từ năm 1908 : Nội
dung chính của luật là quy đinh về tiêu chuẩn của các loại thực
phẩm, hình thức kinh doanh. Trong đó quy định cụ thể về các biện
pháp báo vệ thực phẩm khỏi bị ô nhiễm thông qua các quy đinh về
con người, đồ bao gói (The pure food Act, 1908).
Tại Mỹ cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm (FDA) có nhiệm vụ đảm

bảo cho hầu hết các loại thực phẩm và dược phẩm an tồn và khơng có độc tố.

Tại Châu âu: Quy định chung của Châu âu (EC) số 2073/2005, chỉ rõ
giới hạn các chỉ tiêu gây mất vệ sinh, và các vi khuẩn gây mất an tồn thực
phẩm khơng được phép có mặt trong từng loại thực phẩm, đồng thời trong
quy đinh cũng chỉ định việc áp dụng các phương pháp xét nghiệm.

9


Bảng 2.1. Qui định chung của Châu âu (EC) số 2073/2005 về tiêu chuẩn vi sinh đối thịt và sản phẩm thịt

Kế hoạch

Loại Thực

phẩm

lấy mẫu

Vi sinh vật

Thịt vụn

Thịt pha lọc

Sản phẩm thịt
Thân thịt gia
súc: trâu bò,
cừu, dê, ngựa

n
5

c
2

5

2

Tổng số
VSVHK
E.coli

5

2

5

2

E.coli

5

2

Salmonella

50

2

Salmonella

50

5

Salmonella

50

7

Tổng số
VSVHK
E.coli

Thân thịt lợn

Thân thịt
gia cầm

Ghi chú: n: số mẫu cần lấy từ lô hàng kiểm tra

c: số mẫu tối đa cho phép có kết quả kiểm nghiệm nằm giữa m và M. Trong n mẫu kiểm nghiệm được phép có tối đa c mẫu cho kết quả kiểm nghiệm nằm gữa m và M.
m: giới hạn dưới, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm tất cả các kết quả không vượt quá giá trị m là đạt.

M: giới hạn trên, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm chỉ 01 mẫu cho kết quả vượt quá giá trị M là không đạt


10