Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng việt nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM

TRẦN HỒI NAM
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ
SEPTIN 9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM

Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Cơng nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khóa học

: 2016-2020

Thái Nguyên - năm 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM

TRẦN HỒI NAM

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TÌNH TRẠNG METHYL HỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SEPTIN
9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG VIỆT NAM

Hệ đào tạo

: Chính quy

Ngành

: Cơng nghệ sinh học

Lớp

: 48-CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2016-2020

Người hướng dẫn

: 1. PGS.TS. Dương Văn Cường

2. Th.S.Vũ Hoài Nam

Thái Nguyên, năm 2020


i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hồn thành được khố luận tốt
nghiệp này cùng với sự nỗ lực của cá nhân, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp
đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cơ, bạn bè và gia đình.
Em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Dương Văn Cường,
TS. Hoàng Phú Hiệp, Th.S Vũ Hoài Nam, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp
đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận
văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa CNSH - CNTP đã dạy dỗ
và giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn đến tới các cán bộ, anh chị làm việc tại Viện
Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện để em được học
tập và nghiên cứu.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn
động viên, chia sẻ giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong q trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thiện bản thân.
Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày

tháng

Sinh viên

Trần Hoài Nam

năm 2020


ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Bảng liệt kê các hoá chất cần sử dụng trong q trình thí nghiệm.............20
Bảng 3.2. Bảng liệt kê các dụng cụ cần thiết trong quá trình thí nghiệm..................... 21
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA với bốn phương pháp................................ 23
Bảng 3.4. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde bằng phương
pháp A..................................................................................................................................................... 23
Bảng 3.5. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde bằng
phương pháp B.................................................................................................................................... 24
Bảng 3.6. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mơ người cố định formaldehyde bằng
phương pháp C.................................................................................................................................... 25
Bảng 3.7. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô người cố định formaldehyde bằng bộ
Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit [Theo hướng dẫn nhà sản xuất FavorPrep]

26
Bảng 3.8 : Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde của
bệnh nhân ung thư đại trực tràng.................................................................................................. 28
Bảng 3.9: Bố trí thí nghiệm............................................................................................................ 29
Bảng 3.11: Thành phần phản ứng PCR...................................................................................... 31
Bảng 3.12: Bố trí thí nghiệm chạy PCR khuếch đại gene FAT1...................................... 32
Bảng 4.1: Thống kê về độ tuổi phát hiện bệnh ung thư đại trực tràng...........................34
Bảng 4.2 : Thống kê giới tính của bệnh nhân ung thư đại trực tràng............................. 34
Bảng 4.3: Thống kê về giai đoạn phát hiện bệnh................................................................... 35
Bảng 4.4: Thống kê tỷ lệ phát hiện bệnh khi đã bị di căn của nghiên cứu này và tỷ lệ
tương tự của Hoa Kỳ (được công bố bởi Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ)............................. 35

Bảng 4.5 : Kết quả đo nồng độ DNA.......................................................................................... 38
Bảng 4.6 : Kết quả đo tỷ số OD260/280......................................................................................... 39
Bảng 4.7 : Kết quả đo tỷ số OD260/230......................................................................................... 40
Bảng 4.8: Kết quả mức độ nhiễm tạp chất và phenol trong mẫu DNA của bốn phương

pháp......................................................................................................................................................... 41
Bảng 4.9: Thống kê 4 phương pháp............................................................................................ 42
Bảng 4.10 : Kết quả đo nồng độ DNA....................................................................................... 44


iii

Bảng 4.11: Kết quả đo tỷ số OD260/280........................................................................................ 45
Bảng 4.12: Kết quả đo tỷ số OD260/230........................................................................................ 45
Bảng 4.13 : Trình tự promoter trên gene SEPT9.................................................................... 47


iv

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 : Hình ảnh vị trí đại tràng và trực tràng ở người.................................................. 13
Hình 2.2: Quá trình xác định mức độ methyl hố của DNA............................................. 17
Hình 3.1: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene FAT1............................30
Hình 3.2: Chu trình nhiệt chạy PCR khuếch đại gene FAT1............................................. 31
Hình 3.3 : Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene FAT1................................... 32
Hình 4.1. DNA được tách chiết từ mẫu mô cố định formaldehyde được tách chiết từ
bộ KIT chuẩn của cơng ty Clini Sciences................................................................................. 36
Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm DNA được tách từ 4 phương pháp A, B, C và bộ

KIT........................................................................................................................................................... 37

Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm DNA được tách chiết từ mẫu mơ 14173 - U
phương pháp B.................................................................................................................................... 43
Hình 4.4: Vị trí và kích thước của gene SEPT9..................................................................... 46
Hình 4.5: Thiết kế mồi khuếch đại promoter của gene SEPT9........................................ 47
Hình 4.6: Kết quả chạy khuếch đại gene FAT1...................................................................... 48
Hình 4.7: Kết quả PCR khuếch đại gene FAT1...................................................................... 49
Hình 4.8: Kết quả PCR gen FAT1................................................................................................ 49


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG........................................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................................... iv
MỤC LỤC............................................................................................................................................... v
Phần 1. MỞ ĐẦU................................................................................................................................ 8
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................................................... 8
1.1 Mục tiêu của đề tài........................................................................................................................ 9
1.1.1 Mục tiêu tổng quát..................................................................................................................... 9
1.1.2 Mục tiêu cụ thể........................................................................................................................... 9
1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.................................................................................................. 9
1.2.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài................................................................................................... 9
1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài................................................................................................... 9
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................... 10
2.1. Ung thư.......................................................................................................................................... 10
2.1.1. Khái niệm ung thư................................................................................................................. 10
2.1.1. Cơ chế hình thành bệnh ung thư...................................................................................... 10
2.2. Ung thư đại trực tràng.............................................................................................................. 12
2.2.1. Khái niệm................................................................................................................................. 12

2.2.2. Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng................................................................... 13
2.2.3. Tình hình ung thư đại trực tràng...........................Error! Bookmark not defined.
2.3. Mối liên hệ giữa Methyl hoá DNA và ung thư đại trực tràng.................................. 14
2.3.1. Methyl hoá DNA................................................................................................................... 14
2.4. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi bisulfite

16
2.5. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina Infinium

450K........................................................................................................................................................ 17
2.6. Nghiên cứu trong nước và quốc tế về methyl hóa của gene SEPT9 trên bệnh nhân

ung thư đại trực tràng........................................................................................................................ 17


vi

Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........20
3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu............................................................... 20
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................................... 20
3.1.2. Phạm vi nghiêm cứu............................................................................................................. 20
3.1.3. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm......................................................................................... 20
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu....................................................................................... 21
3.3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................................ 21
3.4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................ 22
3.4.1. Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu ung thư CRC ở bệnh viện K TW. 22
3.4.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde........................22
3.4.3. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hoá bằng phương pháp thiết kế
Insilicon................................................................................................................................................. 28
3.4.4. Q trình chuyển hố bisulfite cho mẫu DNA........................................................... 29

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................................... 34
4.1. Kết quả thu thập và phân tích số liệu lâm sàng trên 151 mẫu bệnh phẩm của bệnh

nhân ung thư đại trực tràng được thu thập ngẫu nhiên tại bệnh viện K TW................34
4.1.1. Kết quả phân tích về độ tuổi phát hiện ung thư.......................................................... 34
4.1.2. Kết quả phân tích về giới tính........................................................................................... 34
4.1.3. Kết quả phân tích về giai đoạn phát hiện bệnh........................................................... 35
4.1.4. Khảo sát về tỷ lệ mức độ cả bệnh khi phát hiện ra bị ung thư đại trực tràng tại
bệnh viện K TW.................................................................................................................................. 35
4.2. Kết quả tách chiết DNA.......................................................................................................... 36
4.2.1. Kết quả lựa chọn phương pháp phù hợp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định
formaldehyde....................................................................................................................................... 37
4.2.3. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde bằng B đã tối ưu và

phương pháp sử dụng Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit................................. 43
4.3. Kết quả thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hố............................................................. 46
4.3.1. Thu thập thơng tin gene SEPT9 từ cơ sở dữ liệu database.................................... 46
4.3.2. Xác định trình tự promoter trên gene SEPT9.............................................................. 47
4.3.3. Thiết kế mồi PCR đặc hiệu methyl hóa......................................................................... 47


vii

4.4. Kết quả chuyển hoá bisulfite đối với DNA được tách chiết từ mẫu mô cố định
formaldehyde của bệnh nhân ung thư đại trực tràng............................................................ 48
4.4.1. Kết quả chất lượng DNA chuẩn bị cho quá trình biến đổi bisufite..................... 48
4.4.2. Kết quả chuyển đổi bisufite............................................................................................... 50
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 51
5.1. Kết luận......................................................................................................................................... 51
5.2. Kiến nghị...................................................................................................................................... 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................... 52


Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC) là một trong những loại ung
thư phổ biến ở người. Trên thế giới, CRC xếp thứ 3 về tỷ lệ người mắc bệnh sau ung
thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới, đứng thứ 2 sau ung thư vú ở nữ giới.

Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc CRC đứng thứ năm sau ung thư gan, phổi, dạ dày và
vú. Tỉ lệ mắc CRC chiếm 8,7% tổng số bệnh nhân ung thư.[1]
Hằng năm, có hơn 945.000 người mắc bệnh ung thư đại trực tràng trên thế giới
và có khoảng 492.000 bệnh nhân tử vong, trong số đó bệnh nhân châu Á chiếm 51,3%
tổng số ca mắc trên tồn thế giới. Theo dự đốn của các chuyên gia tại Hội thảo Ung

thư Việt Pháp lần thứ 3 diễn ra tại Hà nội, tới năm 2025 ung thư đại trực tràng sẽ
vươn lên hàng thứ hai ở nam giới và thứ tư ở nữ giới.
Việc sàng lọc thường xun có thể giúp phịng ngừa và phát hiện sớm ung
thư đại trực tràng. Theo thống kê của Hiệp hội phịng ngừa Hoa Kỳ cơng bố mỗi
năm có khoảng 60% bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng tử vong, nếu được sàng lọc
định kỳ thường xuyên tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh có thể sống thêm 5 năm tăng từ
46% đến 73%. Vì thế việc được sàng lọc thường xuyên sẽ giúp kéo dài thời gian
sống khi phát hiện kịp thời.[5]
Trong số những cơ chế gây nên ung thư nói chung và ung thư đại trực tràng
nói riêng, cơ chế methyl hố DNA có vai trị quan trọng. Những biến đổi về di
truyền ngoại gen (epigenetic) có liên quan tới q trình phát sinh ung thư. Nghiên
cứu tình trạng methyl hố DNA có tiềm năng ứng dụng cao trong sàng lọc, chẩn
đoán lâm sàng và theo dõi điều trị ung thư.

3

Gen SEPT9 ở người là một trong những chỉ thị sinh học hàng đầu để giúp
phát hiện và chẩn đoán lâm sàng một số bệnh ung thư trong đó có ung thư đại trực
tràng.[5] Trên thế giới đã có những nghiên cứu về tình trạng methyl hoá ở gene
SEPT9 của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, tuy nhiên những nghiên cứu trên đa số
đều nghiên cứu trên đối tượng người da trắng và người da đen. Mặt khác, methyl
hố DNA có một phần ngun nhân phụ thuộc vào sắc tộc và môi trường sống.


Hiện nay, theo tìm hiểu của chúng tơi chưa có một nghiên cứu nào nghiên
cứu về tình trạng methyl hố DNA trên gene SEPT9 của bệnh nhân ung thư đại trực
tràng Việt Nam.
Xuất phát từ những luận điểm trên, chúng tơi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu
tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng
Việt Nam”.
1.1 Mục tiêu của đề tài
1.1.1 Mục tiêu tổng quát
Thiết lập một số kỹ thuật làm nền tảng cho nghiên cứu khảo sát mức độ
methyl hóa chỉ thị SEPT9 trên khối u của bệnh nhân CRC Việt Nam.
1.1.2 Mục tiêu cụ thể
-

Thu thập và phân tích một số dữ liệu lâm sàng trên tập hợp 151 mẫu bệnh

phẩm của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được thu thập ngẫu nhiên tại Việt Nam.
-

Tìm và tối ưu được phương pháp thích hợp để tách chiết DNA từ mẫu mô cố

định formaldehyde. Tách chiết khoảng 50 mẫu DNA và đánh giá được chất lượng.

-

Phân tích in silico cấu trúc gene SEPT9 và thiết kế được bộ mồi PCR đặc

hiệu methyl hoá.
-

Thực hiện được kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hóa.

1.2 . Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.2.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài
Nghiên cứu tình trạng methyl hoá chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung
thư đại trực tràng Việt Nam tạo tiền đề cho các nghiên cứu về methyl hoá gen chỉ thị
phân tử khác của các bệnh ung thư.
1.2.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Nghiên cứu tình trạng methyl hố chỉ thị phân tử SEPT9 ở bệnh nhân ung
thư đại trực tràng Việt Nam mở ra những hướng nghiên cứu liên quan đến ứng dụng
trong sàng lọc, chẩn đoán và hỗ trợ điều trị bệnh ung thư đại trực tràng.


Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Ung thư
2.1.1. Khái niệm ung thư
Ung thư là sự tăng trưởng bất thường của các tế bào. Ung thư có thể phát
sinh từ bất cứ cơ quan nào trên cơ thể hoặc có thể là các tế bào nhỏ đã mất khả năng
ngừng phát triển, dẫn đến cơ thể bị mất khả năng kiểm soát.[1]
2.1.2. Cơ chế hình thành bệnh ung thư

Có nhiều tác nhân gây ung thư, tất cả đều làm biến đổi hoặc đột biến các tế
bào trong cơ thể dẫn đến sự tăng sinh mất kiểm soát của các tế bào này. Cơ thể được
cấu tạo từ rất nhiều loại tế bào, các tế bào đều có sự phát triển và phân chia một
cách có kiểm sốt, các tế bào sẽ chết theo chu trình được lập sẵn (chương trình
Apoptosis) và thay vào là các tế bào mới mạnh khoẻ để duy trì các chức năng của
cơ thể. Các tác nhân gây đột biến như hố chất độc hại, tia phóng xạ, các virus ung
thư làm cho các tế bào bình thường bị đột biến gene hoặc NST, nên tế bào mất khả
năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào. Vật liệu di truyền (DNA) của một tế
bào bị thay đổi hoặc hư hỏng làm tăng sinh vô tổ chức các tế bào lỗi (tế bào ung
thư). Các tế bào khơng chết đi theo chương trình Apoptosis như các tế bào bình
thường mà tăng sinh và nhân lên một cách mất kiểm sốt. Các tế bào này có thể sẽ
tạo thành một khối lớn gọi là khối u. Không phải khối u nào cũng là ung thư, các
khối u không lây lan ra các phần khác của cơ thể là khối u lành tính, khơng phải ung
thư. Các khối u lành tính được cắt bỏ và đa số sẽ tái phát. Các khối u có khả năng di
căn sang các phần khác gọi là u ác tính hay cịn được gọi là ung thư.[1]
Cơ chế gây bệnh ung thư do đột biến gene làm mất kểm soát chu kỳ tế bào.
Cơ thể có hai nhóm gene kiểm sốt chu kỳ của tế bào: Nhóm gene quy định yếu tố
sinh trưởng và nhóm gene gây ức chế khối u. Ở các tế bào bình thường hai nhóm
gene này hoạt động hài hồ với nhau. Tuy nhiên khi có đột biến, cơ chế này bị phá
vỡ và tế bào nhân lên khơng kiểm sốt.[1]
Các giai đoạn phát triển của ung thư [1] :


- Giai đoạn khởi phát: Bắt đầu từ khi tế bào gốc tiếp xúc với các tác nhân gây
đột biến và trở thành tế bào khởi phát.
-

Giai đoạn tăng trưởng, thúc đẩy, chuyển biến: tế bào ung thư còn ở mức độ

nhỏ, cư trú ở một mô trên cơ thể

-

Gian đoạn lan tràn: Giai đoạn này có thể kéo dài vài tháng hoặc vài năm.

Các khối u tăng sinh mạnh mẽ.
-

Giai đoạn tiến triển, xâm lấn, di căn: Giai đoạn này là sự tăng kích thước của

các khối u. Đây là giai đoạn khối u phát triển nhanh và xâm lấn các mơ tổ chức khác.

Có rất nhiều ngun nhân gây nên bệnh ung thư, như: Yếu tố di truyền, tiếp
xúc với các chất hố học, các tia phóng xạ, hút thuốc lá thường xuyên, chế độ ăn
uống không lành mạnh, lười vận động …Hầu hết các ung thư lần đầu được chẩn
đoán dựa vào các triệu chứng xuất hiện hoặc nhờ vào q trình tầm sốt. Qua đó
khơng thể chẩn đoán xác định được mà phải nhờ vào sinh thiết. Một số trường hợp
ung thư khác được chẩn đoán tình cờ nhờ khi đang khám hoặc điều trị bệnh khác.
Triệu chứng của hầu hết các bệnh nhân ung thư đều không rõ ràng. Khi xuất
hiện triệu chúng rõ ràng thường là khi bệnh đã tiến triển trầm trọng. Thông thường ung
thư có thời gian ủ bệnh khá dài, khoảng 10 năm hoặc hơn nữa tuỳ vào từng thể loại ung
thư. Do đó cách phịng và điều trị ung thư hiệu quả nhất được khuyến cáo là nên đi
khám sức khỏe định kì 6 tháng một lần. Do ung thư là tập hợp của nhiều dạng bệnh
khác nhau nên triệu chứng của ung thư rất đa dạng và khác nhau tuỳ vào từng thể loại
ung thư. Nói chung, triệu chứng của ung thư được chia làm ba nhóm chính :

Triệu chứng tại chỗ: Các khối u bất thường hay phù nề, chảy máu, đau hoặc
loét. Chèn ép vào các mô xung quanh có thể gây ra các triệu chứng như vàng da.
Triệu chứng di căn : Hạch bạch huyết lớn lên, ho ra máu, gan to, đau xương,
gãy xương ở những xương bị tổn thương và các triệu chứng thần kinh. Đau có thể
gặp ở ung thư giai đoạn tiến triển, nhưng thơng thường đó khơng phải là triệu chứng

đầu tiên.
Triệu chứng toàn thân : Sụt cân, chán ăn, suy mịn, tiết nhiều mồ hơi, thiếu
máu và các hội chứng cận u đặc hiệu, đó là tình trạng đặc biệt được gây ra bởi ung
thư đang hoạt động, chẳng hạn như huyết khối hay thay đổi nội tiết tố.


2.2. Ung thư đại trực tràng
2.2.1. Khái niệm
Ung thư đại trực tràng (CRC) hay còn gọi là ung thư ruột, ung thư ruột kết
hoặc ung thư trực là một trong những ung thư hàng đầu trên thế giới cũng như ở
Việt Nam. Ung thư đại trực tràng được đánh giá là dạng ung thư đứng thứ ba ở Mỹ
trên cả nam và nữ .Ở Việt Nam, ung thư đại trực tràng là ung thư phổ biến thứ năm
sau ung thư gan, phổi, dạ dày, vú.[5]
Ung thư đại trực tràng thường xuất hiện phổ biến ở những người trên 50
tuổi.Tuy nhiên, những năm gần đây ung thư đại trực tràng có xu hướng xuất hiện
ngày càng nhiều ở những người có độ tuổi trẻ hơn. Theo số liệu thống kê của WHO
2018, Việt Nam mỗi năm ghi nhận 15.000 ca mắc mới, tỷ lệ 13,4/100.000 dân và
khoảng 7.000 ca tử vong. Trên thới giới, mỗi năm có thêm 8 triệu ca mắc mới, trong
đó có 860.000 ca tử vong và con số này đang khơng ngừng tăng lên. Trong đó, các
quốc gia châu Á chiếm 51,3% tổng ca mắc trên toàn cầu.[18]
Đại tràng và trực tràng là phần cuối của hệ thống ống tiêu hóa, thường gọi là
ruột già, đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý các thức ăn khơng tiêu hóa được (chất
xơ,...), một số vi khuẩn ở ruột già có thể sản xuất các vitamin cho cơ thể, hấp thụ thức
ăn và tạo nên phân để thải ra ngoài. Đại trực tràng ở người trường thành thường có kích
thước khoảng 1,5 - 1,8 m; phần ruột lớn hình chữ N gồm manh tràng, đại tràng lên, đại
tàng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng. Trực tràng là đoạn cuối của
ống tiêu hóa đi từ chỗ nối đại tràng sigma cho đến đường lược, dài khoảng 15 cm. Trực
tràng chia làm 3 phần: trực tràng trên cách rìa hậu mơn 12-

18 cm, trực tràng giữa cách rìa hậu mơn 6-12 cm và trực tràng rìa hậu môn dưới 6

cm.[2]


Hình 2.1 : Hình ảnh vị trí đại tràng và trực tràng ở người [2]
CRC là loại ung thư hay gặp đứng thứ 2 trong các loại ung thư đường tiêu hóa
và là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong nếu khơng được chẩn
đốn và điều trị sớm. CRC thường gặp là ung thư tuyến biểu mô, gây nên bởi sự
phát triển bất thường của các tế bào có khả năng xâm lấn hoặc lan rộng ra các bộ
phận khác của cơ thể và bắt gặp ở bất kì vị trí nào của đại trực tràng. Theo nghiên
cứu của Kahamoui cho thấy 43% ung thư xảy ra ở vị trí của trực tràng, 25% là ở đại
tràng sigma, đại tràng lên chỉ 18%, đại tràng ngang 9% và đại tràng xuống là 5%.
2.2.2. Các yếu tố nguy cơ ung thư đại trực tràng
Có rất nhiều yếu tố nguy cơ gây nên bệnh CRC. Dựa vào thống kê có hai
nhóm yếu tố chính gây bệnh[1]:
Yếu tố di truyền:
-

Hoạt hóa các gene tiền ung thư, bất hoạt các gene ức chế khối u, sai hỏng

trong sửa chữa ADN và di truyền.
-

Trong yếu tố di truyền, khi có thành viên trong gia đình được chẩn đốn -

mắc bệnh ung thư đại trực tràng thì nguy cơ mắc bệnh các thành viên khác cao gấp
nhiều lần so với mức trung bình, phụ thuộc vào số thành viên mắc bệnh và độ tuổi
mắc bệnh. Ngồi ra, có mối liên quan giữa các hội chứng bệnh và CRC: hội chứng
Lynch, hội chứng Turcot, hội chứng Peutz-Jeghers sẽ dẫn đến bệnh CRC.
Yếu tố không di truyền:

-

Viêm loét dạ dày lâu ngày, các tác nhân vật lý hóa học, chế độ ăn uống sinh

hoạt hay do lão hóa.
Thói quen ăn uống: Chế độ ăn uống ít chất xơ, giàu đạm hay thói
quen sử
dụng bia rượu, hút thuốc lá thường xuyên có thể gây ra những biến đổi trong tế bào
mô đại tràng dẫn đến viêm loét trực tràng và dẫn tới CRC.
2.3 . Mối liên hệ giữa Methyl hoá DNA và ung thư đại trực tràng
2.3.1. Methyl hoá DNA
2.3.1.1. Khái niệm
’

Methyl hoá DNA là hiện tượng gắn thêm gốc methyl (-CH 3) vào vị trí 5 C của
nucleotide. Ở một số trường hợp, Adenine bị methyl hố phổ biến đóng vai trị quan
trọng trong cơ chế bảo vệ đối với vi khuẩn. Trong khi đó ở động vật có vú, methyl hố
xảy ra ở cytosine đứng trước guanine trong phức CpG tạo thành 5 methyl Cytosine
(5mC). Trong hệ gen người, đảo CpG là vùng nhiều phức CpG có kích thước từ 0,5 –
5,0 kb và thường tìm thấy ở các vùng promoter của các gen. Khi các đảo CpG bị
methyl hố, các gen khơng được phiên mã. Methyl hoá xảy ra ở các đảo CpG thuộc
vùng promoter của gen chiếm ưu thế so với các vị trí khác, bởi vậy khi đánh giá tình
trạng methyl hố DNA thường xem xét tại vùng chứa đảo CpG. Ngoài ra, methyl hố
DNA có vai trị nhất định đối với các tế bào ở trạng thái bình thường như in dấu gen,
duy trì trạng thái dị nhiễm sắc, duy trì trạng thái bất hoạt một gen nhiễm sắc thể X ở
động vật có vú. Ở tế bào bình thường, các Cytosine trong phức CpG khơng bị methyl
hố trong q trình phát triển và biệt hố mơ, tuy nhiên các đảo CpG thuộc vùng
promoter của gen có thể bị methyl hố dẫn đến tình trạng ức chế quá trình phiên mã
của gen. Methyl hố DNA được hình thành trong q trình biệt hoá tế bào, làm tế bào

mất một phần hoặc mất hoàn toàn khả năng phân chia tế bào. Methyl hố DNA có tính
đặc hiệu với các mơ trong cơ thể và vai trò của hiện tượng này ở các tế bào khác nhau
là không giống nhau. Ở tế bào bình thường, promoter mang các đảo CpG khơng bị
methyl hố có chức năng duy trì cấu trúc nhiễm sắc thực, đây là cấu trúc cho phép gen
được biểu hiện. Tuy nhiên, trong quá trình phát sinh ung thư, CpG vùng promoter nhiều
gen bị methyl hoá gây ức chế biểu hiện gen do thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể thực
thành cấu trúc dị nhiễm sắc.[8]


2.3.1.3. Bất thường methyl hoá DNA trong ung thư đại trực tràng
Ở

người, methyl hóa một số vị trí CpG nhất định trong vùng promoter của

gene ức chế khối u có thể dẫn đến gene không hoạt động và mất chức năng ức chế
khối u dẫn đến sự bắt đầu phát triển của ung thư. Sự thay đổi bất thường của methyl
hóa này đã được tìm thấy phổ biến trong ung thư đại trực tràng. Dựa trên các nghiên
cứu đã công bố, methyl hóa bất thường xảy ra phổ biến ở giai đoạn đầu của bệnh và
nếu kiểm tra tình trạng gene sẽ có thể phát hiện sớm tình trạng di căn ác tính của ung
thư. Việc phát hiện methyl hóa trong các chất dịch của cơ thể như máu, nước tiểu, phân
và mô đang là xu hướng nghiêm cứu của các nhà khoa học trên thế giới.[9]

Gene O6-methyl Quanin-DNA methyl transferase (MGMT) mã hóa cho
enzyme MGMT có chức năng sửa chữa DNA theo cơ chế loại bỏ các chất gây đột
biến và gây độc từ O6-guanine trong DNA. Quá trình methyl hóa MGMT có liên
quan đến việc thiếu biểu hiện mRNA đồng thời mất hàm lượng protein và hoạt động
của enzyme. Sự thay đổi di truyền trong O6-methyl Quanin-DNA methyl
transferase (MGMT), làm suy giảm khả năng của protein MGMT để loại bỏ nhóm
alkyl hóa khỏi guanine O6 và do đó làm tăng tỷ lệ và nguy cơ gây ung thư.[6]
Nhiều cơ chế điều hịa biểu hiện DNA mà khơng làm thay đổi trình tự

nucleotide. Sự điều hịa biểu hiện thơng qua q trình methyl hóa các vùng kích thích
gene là phổ biến ở ung thư đại trực tràng và cũng quan trọng như đột biến DNA trong
việc làm bất hoạt các gene ức chế khối u. Q trình methyl hóa liên quan đến sự liên
kết cộng hóa trị của một nhóm methyl với vị trí 5 của cytosine và diễn ra trong các đảo
CpG lặp đi lặp lại hoặc các đoạn DNA nhiều CpG trong vùng promoter. CpG gắn các
cytosine (C) theo sau là guanosine (G), với một liên kết phosphodiester (p).[6]

Trong các tế bào bình thường, đảo CpG thường được duy trì ở trạng thái
khơng được methyl hóa. Trong trường hợp khơng bị methyl hóa, gene được thể hiện
bình thường. Với sự hiện diện của q trình methyl hóa, gen khơng được điều hịa
phiên mã (tức là im lặng). Sự im lặng của gene ức chế khối u có thể là kết quả của
q trình methyl hóa liên quan đến cả hai bản sao của gene ức chế khối u, hoặc sự
kết hợp mất một alen thông qua việc xóa hoặc đột biến kết hợp với im lặng của alen
khác thơng qua q trình methyl hóa.[6]


2.4. Nguyên lý kỹ thuật xác định mức độ methyl hóa DNA dựa trên biến đổi
bisulfite
Xác định mức độ biến đổi trong q trình methyl hố DNA ngày càng trở nên
quan trọng trong nghiên cứu y sinh và đặc biệt là trong nghiên cứu ung thư, vì các dấu
ấn sinh học có vai trị quan trọng trong việc chẩn đốn ung thư. Một số phương pháp
được sử dụng để phân tích mức độ methyl hố DNA, từ các kỹ thuật xác định các CpG,
đến giải trinh tự gen hoặc lai với các microarrays. Nhiều kỹ thuật phân tích dựa trên các
nguyên lý chung để xử lý DNA bằng bisulfite. Natri bisulfite chuyển đổi các cytosine
khơng bị methyl hố sang uracil, sau đó từ uracil chuyển hố thành thymine sau khi đã
qua quá trình khuếch đại phản ứng polymerase. Ngược lại các cytosine bị methyl hố
sau khi qua q trình bisulfite sẽ khơng bị ảnh hưởng. Vì lý do độ nhạy, bước khuếch
đại sẽ được xử lý sau quá trình bisulfite. Do phép đo các cytosine bị methyl hoá được
đếm sau khi đã khuếch đại mà không phải DNA ban đầu, nên độ chính xác của PCR
ảnh hưởng lớn tới độ chính xác của phân tích.[8]

Sự khuếch đại DNA của kỹ thuật PCR sau khi đã được xử lý qua quá trình
bisulfite thường làm đa dạng có chọn lọc các các alen khơng bị methyl hố, hiện
tượng đó được gọi là sai lệch PCR, do có thể đánh giá khơng chính xác mức độ
methyl hoá. Tuy nhiên mức độ sai lệch PCR rất khó dự đốn. Một số phương pháp
đã được đưa ra để giải quyết các điều kiện thí nghiệm cho sự khuếch đại không sai
lệch. Một trong những phương pháp đấy là sử dụng các cặp mồi PCR được thiết kế
đặc biệt trong đó có chứa các dinucleotide CpG (thường là 1 hoặc 2). Sử dụng cặp
mồi đặc hiệu các tác dụng tạo điều kiện cho cặp mồi gắn được vào các alen bị
methyl hố và do đó có thể tránh được việc khuếch đại các alen không cần thiết. Để
tránh sai lệch PCR, người ta thường tối ưu hoá các điều kiệu PCR như: nhiệt độ,
thời gian, … Tuy nhiên phương pháp này tốn nhiều thời gian và cơng sức, vì vậy đã
có một phương pháp khác được đưa ra. Thay vì điều chỉnh các điều kiện của phản
ứng PCR người ta sẽ thay đổi một cách thích hợp các kết quả thu được sau khi
khuếch đại. Để đạt được mục đích này, cần một q trình phân tích xác định được
mức độ methyl hố của các mẫu DNA song song với việc chạy PCR mẫu DNA. So
sánh và đưa ra độ lệch chuẩn chính xác cho kết quả .[8]


Hình 2.2: Q trình xác định mức độ methyl hố của DNA
bằng phương pháp chuyển hoá bisulfite.[8]
2.5. Giới thiệu về kỹ thuật xác định methyl hóa DNA hiệu năng cao Illumina
Infinium 450K
Khi phân tích sự thay đổi methyl hóa DNA trong đảo CpG, phương pháp
điều chỉnh bisulfile natri để phân biệt giữa DNA bị methyl hóa và khơng methyl hóa
kết hợp với sử dụng các enzyme hạn chế nhạy cảm với methyl (ví dụ R. Hpa II) và
specific (ví dụ R. Mcr BCI) hoặc sử dụng thuốc thử đặc hiệu có ái lực cao cho
methyl hóa (ví dụ kháng thể kháng 5meC hoặc polypeptide gắn methyl tái tổ hợp).
Tuy nhiên, các kỹ thuật này địi hỏi trình độ chun mơn cao, chi phí lớn và mất
thời gian. Trong khi đó methyl hoá DNA người Illumina Infinium 450K (Illumina

Infinium Human Methylation 450K BeadChip) được phát triển để đánh giá định
lượng methyl hóa trên bộ gene người hiệu quả trong xác nhận chức năng sinh học
và chức năng methyl hóa của ung thư đại trực tràng. Áp dụng kĩ thuật này để xác
định các vị trí methyl hóa mới có thể tương quan với sự hiện diện của CpG hoặc dẫn
đến việc làm “im lặng gene”.[19]
2.6. Nghiên cứu trong nước và quốc tế về methyl hóa của gene SEPT9 trên bệnh

nhân ung thư đại trực tràng
a. Trên thế giới
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về ứng dụng methyl hóa của gene SET9

trên ung thư đại trực tràng.


Năm 2017, Lele Song, Jia Jia ,Xiumei Peng, Wenhua Xiao và Yuemin Li
cơng bố cơng trình nghiên cứu “Hiệu suất của xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9 và
so sánh với các xét nghiệm sàng lọc CRC khác” chỉ ra rằng xét nghiệm phát hiện
ctDNA để sàng lọc ung thư đại trực tràng và phát hiện sớm cho thấy có độ nhạy và
độ đặc hiệu cao.
Tại Trung quốc, các nhà khoa học đã chỉ ra rằng bệnh nhân ung thư đại trực
tràng có nồng độ methyl hố trên gene SEPT9 dương tính và độ methyl hố trên
gene SEPT9 định lượng có liên quan chặt chẽ với các thông số bệnh lý lâm sàng.
Xét nghiệm methyl hoá trên gene SEPT9 là một cơng cụ chẩn đốn chính xác và
nhanh chóng cho bệnh nhân ung CRC Trung Quốc, nó có thể cho chúng ta biết thêm
thơng tin có giá trị về giai đoạn khối u hiện tại và có khả năng theo dõi tái phát CRC
[ Xue Yang et al., 2019].
Cho đến nay, đã có 25 nghiên cứu độc lập được thực hiện để điều tra hiệu
suất của xét nghiệm methyl hóa gen SEPT9 trong phát hiện CRC, trong đó hầu hết
các nghiên cứu là nghiên cứu trường hợp hoặc đối chứng, trong khi chỉ có một
nghiên cứu sàng lọc đa trung tâm ngẫu nhiên và hai nghiên cứu sàng lọc cơ hội

được thực hiện để điều tra hiệu suất của nó trong dân số có nguy cơ trung bình và
dân số có nguy cơ cao.
Gần đây nhất, ngày 18/4/2020, hai nhà nghiên cứu Rohit Harihara và Mark
Jenkins đã phân tích dữ liệu từ 19 nghiên cứu đã chỉ ra rằng: xét nghiệm mSEPT9
có khả năng sàng lọc CRC dân số với khả năng phát hiện khoảng hai phần ba trường
hợp CRC và loại trừ 92% trường hợp không mắc.[10]
b. Trong nước
Nghiên cứu về methyl hóa trong ung thư ở Việt Nam cịn rất hạn chế. Theo
tìm hiểu của chúng tơi, chỉ có một vài công bố liên quan đến cơ thế methyl hóa chỉ
thị các gene trên bệnh nhân ung thư ở người.
Vũ Tràng Lan và cộng sự năm 2018 nghiên cứu methyl hóa BRCA1,
RASSF1A và GSTP1 ở phụ nữ Việt Nam bị ung thư vú đã chỉ ra rằng sự methyl hóa
trong các mơ khối u của BRCA1, RASSF1A và lần lượt là 58,23%, 74,68% và
59,49% và ở các mô lân cận tương ứng là 51,90%, 63,29% và 35,44% .[11]


-

Nghiên cứu sự liên quan giữa methyl hoá gene DcR1 và ung thư cổ thử cung

của phụ nữ Việt Nam đã chỉ ra rằng quá trình hypermethylation của gen DcR 1 là một

đặc điểm quan trọng của các bệnh nhân nhiễm HPV có nguy cơ ung thư cổ tử cung.
[12]
-

Võ Thị Thường Lan và cộng sự chỉ ra rằng quá trình methyl hóa GSTP1 và

RASSF1A bằng có thể được sử dụng như một dấu ấn sinh học để chẩn đoán ung thư
tuyến tiền liệt khi nghiên cứu methyl hóa Promoter của GSTP1 và RASSF1A trong

ung thư tuyến tiền liệt và tăng sản lành tính ở nam giới Việt Nam.[13]
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào cơng bố về nghiên cứu mức độ methyl
hoá chỉ thị gene SEPT9 của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam.


Phần 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu khối u và tế bào lành liền kề khối u của bệnh nhân ung thư đại trực
tràng Việt Nam được bảo quản trong dung dịch formaldehyde được cung cấp bởi
bệnh viện K TW.
3.1.2. Phạm vi nghiêm cứu
Nghiên cứu tình trạng methyl hố của gen SEPT9 ở bệnh nhân ung thư đại
trực tràng tại Việt Nam
3.1.3. Vật liệu và dụng cụ thí nghiệm
3.1.3.1. Vật liệu
a. Vật liệu
Mẫu khối u và tế bào lành liền kề khối u của bệnh nhân ung thư đại trực
tràng Việt Nam được cố định formaldehyde được cung cấp bởi bệnh viện K TW
b. Hoá chất
Bảng 3.1. Bảng liệt kê các hoá chất cần sử dụng trong q trình thí nghiệm
STT
1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23

Tên hố chất sử
Cồn
Nước cất, nước khử ion
GTE (100mM glycine, 10mM Tris – HCL pH=
Lysis buffer (Tris Hcl 1M, EDTA 05M, SDS 10
Proteinase K (Thermo Scientific)
Rnase (Thermo Scientific)
Loading dye…(Thermo Scientific)
Gene Ruler (Thermo Scientific)
Ethidium Bromide
PBS (Na2HPO4 . 2H20, NaH2PO4. H2O, Nacl)
TAE 1X (Tris base, Acid acetic, EDTA)
Agarose

TE (100mM Tris/1mM EDTA)
CIAA (Chloroform, Isoamylakihol)
Alkali (0,1M NaOH, SDS 1%, pH= 12)
10X DreamTaq Buffer (Thermo Scientific)
DreamTaq DNA Polymerase (Thermo Scientifi
10 mM dNTP Mix (Thermo Scientific)
Dung dịch 25:24:1 (Phenol, Chloroform, Isoam
Cặp mồi FLI1 CpG U (PHUSA Biochem)
Cặp mồi USP44 CpG U (PHUSA Biochem)
Cặp mồi USP44 CpG M (PHUSA Biochem)
Cặp mồi FAT1 (PHUSA Biochem)


3.1.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
Bảng 3.2. Bảng liệt kê các dụng cụ cần thiết trong q trình thí nghiệm
STT

Dụng cụ và thiết bị

1

Pipette, dao, kéo,phanh, giấy parafilm

2

Ống Eppendorf (2ml; 1,5ml; 200µl; 10
Fancol 15 ml

3

Bộ Tissue Genomic DNA Extraction Mini

4

Bộ EZ DNA Methylation - Gold

5

Ống đong, cốc đong, bình định mức, b
nhiệt,…

6

Máy chuẩn pH, máy khấy từ, lị vi sóng, tủ

7

Tủ cấy, tủ hút khí

8

Máy IK Votex, máy lắc, máy spindowwn

9

Máy ly tâm lạnh Mikro 220R

10

Bể ổn nhiệt

11

Bể điện di

12

Máy soi gel Wealtec corp

13

Máy phân tích hình ảnh

14

Máy PCR

15

Máy PCR

16

Máy đo độ quang phổ Naodrop One

3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen, Viện Khoa học sự
sống, Đại học Thái Nguyên.
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2019 đến tháng 7/ 2014.
3.3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân tích một số dữ liệu lâm sàng trên 151 mẫu bệnh phẩm
được thu thập ngẫu nhiên tại bệnh viện K TW.


Nội dung 2: Phân tích kết quả DNA được tách từ mẫu mơ cố định
formaldehyde
-

Tìm ra quy trình tối ưu tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde

của bệnh nhân ung thư đại trực tràng.
Phân tích kết quả số liệu DNA tách chiết từ mẫu mô cố định
formaldehyde.
-

Truy xuất trình tự gene.

-

Tìm kiếm vị trí promoter và vị trí CpG cần quan tâm.

-

Thiết kế mồi đặc hiệu methyl hoá.

Nội dung 4: Chuyển đổi bisulfite cho DNA được tách chiết từ mẫu mô cố
định fomaldehyd của bệnh nhân ung thư đại trực tràng
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp thu thập và đánh giá số liệu ung thư CRC ở bệnh viện K TW
Thông tin dữ liệu lầm sàng của bệnh nhân được thu thập, tổng hợp bằng phần

mềm Excel 2010.
Các chỉ tiêu: Giới tính, độ tuổi, giai đoạn phát hiện bệnh, tình trạng bệnh
được tổng hợp, phân tích và đánh giá.
3.4.2. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde
3.4.2.1. Lựa chọn phương pháp phù hợp để tiến hành tách chiết DNA
Nhận thấy sự khó khăn trong việc tách chiết DNA từ mẫu mơ cố định
formaldehyde, nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm tách chiết với 4 phương pháp hoàn
toàn khác nhau để đưa ra những so sánh cụ thể:
- Phương pháp 1: Tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde bằng
phương pháp sử dụng bộ KIT Tissue Genomic DNA Extraction Mini Kit được thiết
kế chuyên biệt cho việc tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyd.
- Phương pháp 2: Dựa trên phương pháp của Campos và Gilbert (2012) để tách

chiết DNA từ mẫu gan cố định fomaldehyde.[14]

.

Phương pháp 3: Nhận thấy sự khó khăn tương đồng giữa tách chiết
DNA từ
mẫu mô cố định fomaldehyde và tách chiết DNA từ móng tay, vì vậy nhóm nghiêm


cứu đã thử nghiệm tách chiết DNA từ mẫu mô cố định fomaldehyde bằng phương
pháp tách chiết DNA từ móng tay theo phương pháp của Alexander (2016).[15]
-

Phương pháp 4: Nhóm nghiên cứu thử nghiệm với một quy trình hồn tồn

tách biệt khi tách chiết DNA từ mẫu mô ngâm formaldehyde bằng phương pháp của
Phịng ni cấy mơ tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện khoa học

công nghệ Việt Nam được thiết kế để tách chiết DNA từ mẫu lá tươi.[3]
Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm tách chiết DNA với bốn phương pháp
Phương pháp
Kí hiệu
Số lượng mẫu
Khối lượng (mg)
Phương pháp 1: Tách chiết DNA từ mẫu mơ cố định formaldehyde bằng
phương pháp A
Bảng 3.4. Quy trình tách chiết DNA từ mẫu mô cố định formaldehyde
bằng phương pháp A
Bước 1
Bước 2

Bước 3
Bước 4
Bước 5
Bước 6
Bước 7
Bước 8
Bước 9
Bước 10
Bước 11