BÁO cáo THỰC tập VI SINH

BÁO CÁO THỰC TẬP VI SINH
Phương Pháp Định Lượng Vi Sinh Vật
1. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
a. Nguyên tắc
Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành
khuẩn lạc có thể trơng thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế
bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích
giống vi sinh vật nhất định chỉ số lượng tế bào sống trơng thể tích
giống đó. Thơng thường tất cả tế bào ở pha tăng trưởng hay giai
đoạn sớm của pha ổn định đều có khả năng hình thành khuẩn lạc. Vì
vậy, số lượng khuẩn lạc đếm của gần tương tối với số lượng tế bào
sống.
b. Quy trình

I.



Cách pha lỗng mẫu

1




c.



Dùng micropipet hút 0,1 mL của mỗi ống nghiệm ( 10 -5,10-6,10-7)
lên hộp petri và trải.

Kết quả
Bậc pha loãng (d) 10-5
10-6
10-7
Số khuẩn lạc đơn 17
19
6
Mât đô tế bào: N = (CFU/mL) với V = 0,1mL
Bậc pha loãng (d)
10-5
10-6
10-7
Số khuẩn lạc đơn
17
19
6
8
8
Mật độ tế bào 0,17.10 1,9.10 6,0.108

Kết luận
 Ta chỉ lấy đĩa có số khuẩn lạc đơn từ 10-300 trên một đĩa và tỉ lệ
các đĩa không được quá 2.
-5
-6
7
 Vây: N(cuối cùng)=(17+19)/(10 .0,1+10 .0,1)=3,3.10 (CFU/mL)
2. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục.
a. Nguyên tắc

Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử khơng tan, tạo thành một hệ
huyền phù có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trường
lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật
là một thực thể khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi
trường đốc.
Theo phương pháp này,số lượng photon ánh sáng bị phân tán tỉ lệ
thuận với lượng sinh khối tế bào có trong mẫu đem đo (trừ những
mẫu có tế bào đậm đặc ),hay trong những điều kiện sinh trưởng nhất
định thì tỉ lệ với nồng độ tế bào .Tuy nhiên ,lượng ánh sáng lọt vào bộ
tách sóng quang ở mỗi máy đo mật độ quang bị qui định bởi hình
dạng sinh học của máy đó. Vì vậy đường cong chuẩn xác định mối
d.

2


liên quan giữa mật độ hấp thu và nồng độ tế bào phải được thiết lập
riêng cho từng máy đo mật độ quang.
b. Quy trình

c.

Kết quả

Mẫu Giá trị OD600nm
0,1
0,130
0,2
0,259
0,3

0,549
0,4
0,522
0,5
0,163
 Dựng đường chuẩn

Số tế bào vi sinh vật
1,0.108
3,3.107
3,3.108
2,9.109
7,6.108

Log (số VSV)
8,0
7,5
8,5
9,5
8,9

3


Giá trị OD600nm của mẫu phịng thí nghiệm: 0,249 ( pha lỗng 5 lần )
Kết luận
2
 Vì R nên kết quả khơng đáng tin cậy.
 Vì một số thao tác có thể gây sai số trong q trình thực hiện thí
nghiệm

-Thao tác pha lỗng: pha lỗng khơng chính xác
-Thao tác đo OD: cầm cuvette ở phần thân dưới hoặc không lau
chùi bề mặt cuvette trước khi đo ảnh hưởng đến đường truyền
ánh sáng.
-Thao tác chậm làm vi sinh vật bị lắng xuống
-Sai số do máy đo OD
II.
Phương pháp phát hiện vi sinh vật
a. Nguyên tắc
Phát hiên vi sinh vât bằng cách nuôi cấy mẫu vi sinh vât ở các môi
trường chọn lọc khác nhau. Trong điều ki ên nuôi cấy phù hợp, có thể
tm ra vi sinh vât mục tiêu dựa trên sự tăng trưởng ưu thế của chúng
so với các lồi vi sinh vât khác.
b. Quy trình
d.



Cách pha lỗng

4


Kết quả
 Trong môi trường LB xuất hiện khuẩn lạc E.Coli
 Trong môi trường PGA xuất hiện nấm mốc
d. Giải thích
 E.coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển
dễ dàng trên các môi trường ni cấy thơng thường, một số có
thể phát triển được ở mơi trường tổng hợp đơn giản. Nhiệt độ

thích hợp 37℃, pH thích hợp là 7 - 7,2. Với các mơi trường như
PGA, Hansen, Gause thì E.coli vẫn phát triển được nhưng vì
khơng phải là mơi trường thích hợp nhất về pH hay nhiệt độ
nên E.coli bị ác chế. Vì vậy ta chỉ thấy E.coli xuất hiện trên đĩa LB
ở 37℃ vì điều kiên pH và nhiêt đơ là thích hợp nhất
để E.coli phát triển.
 Nấm mốc là vi khuẩn hiếu khí bắt bc. Phát triển
tốt ở mơi trường có pH trong khoảng từ 5-6,5. Nhiêt
đơ thích hợp từ 22-27 tương đương với nhiêt đơ
phịng. Nhưng vì nấm mốc khơng có diêp lục tố nên
cần phải cung cấp chất dinh dưỡng từ bên ngồi.
Chính vì những yếu tố mơi trường PGA là phù hợp
nhất cho nấm mốc phát triển.
c.

III.

Kiểm soát tăng trưởng bởi kháng sinh
a. Nguyên tắc

5


Kháng sinh được tẩm vào đĩa giấy với nồng độ thích hợp sẽ khuếch
tán ra mặt thạch xung quanh, ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn
(càng xa đĩa KS càng giảm)
Đường kính vịng vơ khuẩn diễn đạt được mức độ nhạy cảm của vi
khuẩn với kháng sinh Khơng có vịng vơ khuẩn, vi khuẩn kháng kháng
sinh
b. Quy trình

Kết quả
 Cả hai đĩa giấy đều xuất hiên vòng kháng sinh. Kháng sinh
Ampicilin có đường kính vịng kháng sinh là 1mm. Kháng sinh
Kanamycin có đường kính vịng kháng sinh là 1.9mm.
d. Giải thích
 Ampicilin ức chế tổng hợp thành tế bào khi vi khuẩn khơng có
lớp thành tế bào peptidoglycan bảo vệ thì dễ dàng bị phá vỡ bởi
áp suất. Vì vậy mà mà ta không thấy vi khuẩn sinh trưởng
quanh đĩa kháng sinh.
 Kanamycin ức chế tổng hợp protein gắn vào tiểu phần 30S làm
sai lệch tổng hợp protein nên tiêu diệt được tế bào. Vì vậy mà
ta khơng thấy vi khuẩn sinh trưởng xung quanh đĩa kháng sinh.
 Từ kết quả thực nghiệm ta có thể kết luận được rằng Amp và
Kan có thể kháng được E.coli và khả năng đề kháng sinh của
Kan mạnh hơn Amp.
IV.
Biến dưỡng ở vi sinh vật
1. Phát hiện hoạt tính catalase
c.

6


Nguyên tắc
Enzyme catalase xúc tác quá trình thủy phân hydrogen peroxide H 2O2
thành H2O và O2. Hầu hết các sinh vật hiếu khí đều có catalase nhầm
loại trừ sự tích tụ của phân tử H2O2 có độc tính với tế bào. Hoạt tính
của catalase được phát hiên bằng cách bổ sinh vài giọt H 2O2 lên
khuẩn lạc để theo dõi sự sủi bọt do phân tử O2 được phóng thích.

b. Quy trình
a.

Kết quả
 Ơ phần đĩa có ni cấy E. Coli có hi ên tượng sủi bọt khí.
 Ơ 2 phần đĩa cịn lại ni cấy Bacillus subtilis và Lactobacillus
acidophilus khơng có hiên tượng sủi bọt khí.
d. Giải thích
 Vì Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn kị khí nên khơng có hoạt
tính catalase nên khơng thể phân giải H2O2 nên khơng có hiện
tượng sủi bọt khí.
 Nhưng E.coli và Bacillus là hai vi khuẩn hiếu khí và điều có hoạt
tính catalase nhưng chỉ có một mình E.coli sủi bọt khí vì có thể
trong q trình cấy vi khuẩn Lactobacillus acidophilus đã bị
nhiễm vào Bacillus subtilis nên ta không thể thấy được hiện
tượng.
2. Phát hiện hoạt tính amylase
a. Nguyên tắc
c.

7


Enzyme ngoại bào -amylase xúc tác quá trình thủy phân tinh b ơt
thành đường maltose. Tinh bơt là polysaccharide có cấu trúc mạng
không gian tương đối phức tạp khi môi trường chứa tinh bột được
nhuộm bằng iod , iod bị giữ lại trong cấu trúc mạng không gian của
tinh bột, làm mơi trường có màu xanh đậm . Nếu sinh vật có enzyme
amylase thì sau khi nhỏ iod mơi trường sẽ khơng thay đổi màu thành
xanh đậm.

b. Quy trình
 Tương tự như quy trình phát hiện catalase. Nhưng cấy lên môi
trường LB-tinh bột và thuốc thử là iod.
c. Kết quả
 Ơ 2 phần đĩa nuôi cấy E. Coli xuất hiên màu xanh đ âm.
 Ơ phần đĩa nuôi cấy Bacillus subtilis và Lactobacillus khơng xuất
hiên màu xanh đâm.
d. Giải thích
 Vì Bacillus subtills và Lactobacillus có enzyme -amylase nên có
khả năng phân giải tinh bột thành maltose nên khi cho thuốc
thử iod vào thì sẽ khơng có hiện màu xanh đậm.
 Vì E.coli khơng có enzyme α-amylase nên khơng phân giải được
tinh bột nên khi choi od vào môi trường sẽ xuất hiện màu xanh
đậm.

8