Xác định đột biến gen HBB gây bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

TKf V*:

-u


LỊÌ CÁM ƠN
Với tất ca tấm lịng trân trọng, cm xin bảy tó lịng biết ưn sâu sắc tới GS.TS
Tạ Thành Văn. Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen- Protein Trường Dại học Y
Hà Nội; PGS.TS.BS Trần Vân Khánh. Phó Giám dồc Trung tâm Nghiên cửu GenProtein Trường Dại hợc Y Hà Nội. Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tứ. Trường Dại
Học Y Hà Nội đã tạo diều kiện cho em được thực hiện khóa luận tại trung tâm đồng
thời cùng là người hướng dẫn. tận tỉnh chi báo và giúp dừ em. ln dưa ra nhưng
lời khun hừu ích cùng như những lịi góp ý tâm huyết dè em hồn thành tot bãi
khỏa luận nảy. Em xin bày tó lòng biết on sâu sắc tới TS. Phạm Lê Anh Tuấn, TS.
Nguyen Hoàng Việt, nhưng người thầy tận tỉnh chia sè kỳ thuật và kinh nghiệm
hừu ích trong quá trinh thực hiện thí nghiệm, cúng các anh chị tại Trung tâm
Nghiên cứu Gen - Protein Trường Đại họe Y Hà Nội và ThS. Lê Thị Phương.
Trưởng Đại học Y Hà Nội đà tận lình giúp dờ em dê em hồn chinh khôa luận.
lùn xin chân thành cam ơn Ban Giám Hiệu. Phòng Quan lý Dào tạo Dại
Học. Khoa Kỳ thuật Y hục Trưởng Dại Hục Y Hà Nội đà tạo diều kiện cho em lâm
khóa luận lốt nghiệp.
Lời cuối cùng em xin gưi lời cam ưn tói gia dính, bạn bè. luôn quan tâm.
dộng viên và giúp dừ em trong quá trinh học tập vả nghiên cứu.
Hà Nội. 14 tháng 5 nám 2021
Sinh viên

Vương Thị Hãi Yen
CỘNG HÒA XÂ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Dộc lập - Tự do - Hạnh phúc

TM/ V*:

CAM ĐOAN
Kinh gũi: Phòng Quãn lý dào tạo Dại học - Trường Dại học Y Hà Nội Hội
dồng chẩm khóa luận tốt nghiệp
Tôi xin cam đoan đày là công trinh nghiên cửu cua tôi với sự giúp đờ cua
thầy cô lại Bộ môn Bệnh học phàn tư và các anh chị tại Trung lâm nghiên cứu Gen
- Protein Trường Dại học Y Hà Nội. rắt ca các sổ liệu nghiên cứu trong khóa luận
này lã trung thực và chưa từng được công bố ờ bất cứ công trĩnh nào khác.

Hả Nội. 14 tháng 5 năm 2021
Người viết khóa luận

Vương Thị Hai Yen

TM/ V*:


MỤC LỤC

CHƯƠNG 1:1 ÓNG QUAN................................................................................. 3
1.1
1.2______________
1.3

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.4

PHỤ LỤC
1.5

DANH MỤC BẢNG

1.6.............................................................................................................................
1.7.............................................................................................................................


1.8

DANH MỤC HÌNH

1.9..........................................................................................................................
1.10...........................................................................................................................
1.11

PCR

1.13

Multiplex

1.12

Polymerase Chain Reaction

1.14 Multiplex Amplification Mutation

ARMS-PCR Ml

System Microliters

1.15

nin

1.16

Manometers

1.17

nil

1.18

Milil iters

1.19

ng

1.20

Mano grams

1.21

mg

1.23

pg

1.22
1.25

Miligrams
Picograms

1.24

(L

1.26

Femtoliters

1.27

MCH

1.28

Mean Corpuscular Hemoglobin

1.29
1.31

MCV
(X p ơ ổ Y r. pg

1.33

®/o

1.30 Mean Corpuscular Volume
1.32 Chuồi alpha Chuỗi beta Chuồi delta
Chuỗi
1.34 zeta


1.35

"C bp

1.36 Chuỗi gamma Chuồi epsilon
Micrograms
1.37

Phần tràm

1.38

Độ c

1.40

Hb

1.39

1.41

Basepair
Hemoglobin

1.42

DMA

1.43

Deoxyribonucleic acid

1.44

RNA

1.45

Ribonucleic acid

1.46

mRNA

1.47 Messenger Rbonucleic acid
1.48 DẠT VÁN DÊ

1.49 Bệnh Thalassemia thuộc nhóm bệnh rối loạn tồng hợp huyết sác tố. là
một trong nhùng bệnh di truyền lặn theo quy luật Mendel phố biền nhất trên thế

giói [I]. Bệnh gây ra bới dột biến gen quy dịnh tông hợp chuỗi globin dẫn don giám
hoặc mất hồn lồn sự tơng hợp chuồi nảy, tạo nên bất thường VC huyct sẳc tổ và
thành phàn các loại huyết sắc tố. dần tới hiện tượng vờ hồng cầu và gây ra tính
trạng thiểu máu ờ bệnh nhàn [2]. Bệnh 0- Thalassemia gày ra bơi đột biến gen p
globin nằm trên nhiễm sắc thè (NST) 11. Đột biền trên gen HBB phần lớn là đột
biến diêm [3]. Cho đen nay dà có hem 900 dột biến phát hiện trên gcn P-globin
dược cơng bồ trên tồn thế giới, trong đó có khống hơn 200 đột biến dà được xác
định là gây bệnh 0- Thalassemia. Theo Liên Đoàn Thalassemia Quốc Te. sổ người
mang gen bệnh trên the giới rất lớn. ước tinh khoáng 7% [4], Ở Việt Nam. bệnh |i-


Thalassemia là nguyên nhân hãng đầu gây thiểu máu. tan máu nặng ư tré em [5].
The bệnh lâm sảng nặng nhất cùa bệnh |5-Thalasscmia với kiểu gcn bệnh đồng hợp
tứ, có biểu hiện bệnh thicu máu tan máu nặng nề với nhiều biến chứng trên nhiều
cơ quan cua cơ the. Nhừng người bệnh này cần diều trị truyền mâu vả thái Silt suốt
đời và chất lượng cuộc sống thấp do các biến chứng cùa bệnh. Ngồi ra. bệnh có
thê kết hợp với một bất thưởng cầu trúc hemoglobin với các hình thái làm sàng da
dạng, phơ biến nhất là p- Thalassemia kết hợp với bệnh hemoglobin E (HbE) [6].
Việc những người mang gcn bệnh kct hơn và sinh con chính là nguồn phát lán gen
bệnh chu yếu trong cộng dồng. Hiện nay chưa có phương pháp diều trị bệnh 0Thalassemia triệt dê, một số hưởng nghiên cứu mới như liệu pháp gen vã ghép tế
bâo gốc đà có những bước dầu thành công, tuy nhicn các phương pháp này khá tốn
kém vã không phai lúc não cùng thực hiện dược. Chinh vi vậy. phãt hiện
1.50 nhừng người lãnh mang gcn bệnh đê tư vấn tiền hỏn nhân, chân đoán
trước sinh nhầm hạn chế những thai nhi bị bệnh là một biện pháp hữu hiệu nhàm
giam tý lộ mắc bệnh trong cộng đồng.
1.51 Bệnh ịỉ-Thalassemia được chân đoàn dựa vào phản tích pha hộ, các
đậc diêm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di
truyền phân tứ xác định các đột biền trên gen p-globin là điều kiện thiết yếu khảng
định the bệnh, thực hiện chân dốn trước sinh vã lư van liền hơn nhân về bệnh.
Trong những năm gần dây, một trong số các kỳ thuật sinh học phân lư như

Multiplex ARMS- PCR đã góp phần tích cực trong việc chẩn đốn các kiêu đột


biển gcn giúp cho còng tác tư vần. quan lý nguồn người mang gen vả phông bệnh
ngày càng tốt lum. Tuy nhiên, phương pháp giai trình lự Sanger khơng chi được sử
dụng dê phát hiện hàu hết các dột biến gcn phó biến gãy bệnh p-Thalasscmia mà
cơn được coi là tiêu chuàn vàng trong việc phát hiện nhiều dột biến mói trẽn gen
HBB. đà và dang trờ thành cơng cụ trong chấn đoán thường quy |7). Xuất phát lừ
thực tế trên, chúng tịi thực hiện đề tài •• Xác định đột hiên gen ỈỈBB gây bệnh /ỉThalassemia hăng kỳ thuật giãi trinh tựgen Sanger "vởỉ mục tiêu:
1.52
Phát
hiện
biến trênbàng
gen phương
P-globin
ỡ người
mang
gengen
tự
gây
Sanger.
bệnh
|ỉđột
Thalassemia
pháp
giãi trình


1.53

1.54

Chương l:TÓNG QUAN

1.1 Bệnh P-Thalassemia

1.1.

ỉ

Địnli nghĩa

1.55 Thalassemia là loại bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thê thường, đặc
trưng bời sự suy giam hoặc thiếu hụt tồng hợp chuỗi « hoặc p-globin trong phân tư
Hemoglobin. Bệnh [Ị-Thalassemia xay ra do đột biên diêm trên các locus tạo chuồi p
làm giam hoặc mất chức nâng cùa gen mã hỏa cho việc tống hợp p globin, dẫn đến
giam hoặc không tổng hợp được chuỗi p- globin [8]. 1. 1.2

Dịch tề học bệnh p - Th

alassemia
1.56 Theo Liên đoàn Thalassemia quốc tế (2005). the giới có từ 80-90 triệu
người mang gcn bệnh, và cứ mỏi nãm có tới 60.000 trường hợp mới sinh mang gen
bệnh. Tồn Cháu Á có trên 60 triệu người mang gen p- Thalassemia. Riêng khu vực
Dõng Nam À trong dó có Việt Nam. ước tính sổ người mang gen p-Thalassemia chiếm
tói 50% người mang gcn tồn cẩu. khoang 40 triệu người [9J . Theo thống kè cua Bộ Y
tế nãm 2019. ờ nước ta ước tính có khống 12 triệu người dang mang gcn bệnh (chiêm
khoang 12% dân số Việt Nam), mỏi năm có trên 8000 trê sinh ra bị bệnh, trong đõ cô
hơn 2000 tre mác bệnh ở mửc độ nặng cần được diều trị ca dời và hon 20.000 bệnh
nhân dang cằn dược điều trị theo loại gen nào bị anh hưởng mà phản biệt thành bệnh uThalassemia và p- Thalassemia [5] [10].

1.1.3 Dục điểm làm sàng và phân loại bệnh fi- Thalassemia
1.57 Cản cứ vào đậc diêm làm sàng, cận lâm sáng và số lượng alcn bị dột bicn.
kiều hình bệnh P-Thalasscmia dưọc chia thành 3 thè: thê nặng, thê trung gian và thê
nhẹ.
1.58

Bệnh p-Thalassemia xáy ra do dột biển gen [ỉ-globin dàn den xuẩt hiện nhùng

kiểu gcn sau:
•

p° -Thalassemia lã các đột biến lâm mat chức náng gcn P-globin nén không tống


hợp dưực chuồi P-globin, ví dụ như: dột biền làm tạo thành bộ ba kềt thúc sớm.
•

p-t -Thalassemia là các đột biến lãm giám chức nàng gen p-globin nên giám tông
hợp chuồi p-globin 0 nhiều mức độ khác nhau. Vi' dụ như dột biến ờ vùng khơi
động [11] [12],

1.60 Kiể
u hình

1.59

BãnỊỊ I. ỉ. Phân loại đột biển Ịỉ Thalassemia

1.61

Kiều gcn

1.62

Lâm sàng

1.65 Triệu chứng làm sảng
không rõ ràng
1.63

Nhẹ 1.64

[ỉ°/ p hoặc p +/ p

1.66 I lồng cằu nho nhược
sắc1.70 Biểu hiện lâm sàng

1.68

5°/p+,p+/p +

1.67 Trun 1.69 [Ị°/ p +. p +/ p, p +/ p p°/
g gian
p°. p +/ p +, p°/ p + p°/ p°, p +/
p +. p°/ p + p +/ p hoặc p +/ p

muộn
1.71 Thiếu máu nhẹ. tning
binh
1.72 Không phụ thuộc

truyền máu
1.76 Biêu hiện lâm sàng

1.74

Nặn
g

1.78
1.79

1.75

[ỉo/p°.p+/p+, p°/p+

sớm
1.77 Thiều mâu nặng Phụ

thuộc truyền mâu
Ngồi ra. cịn có cảc thê p-Thalassemia khác, một trong sổ dó lã thê phổi

họp P-Thalassemia và Hemoglobin E (HbE). Bệnh hemoglobin E (HbE) xay ra do đột
biên cẩu trúc gen mã hóa sự san xuằt chuỗi p globin ơ vị tri codon 26. thay thế
nucleotide G thành nucleotide A. làm cho acid glutamic bi thay the bơi lysin. hậu qua là
khiêm khuyết gcn chuồi p globin ca VC sổ lượng vã chất lượng (13].


1
1

1.1.4
1.80

Cư chế bệnh sình bệnh {{-Thalassemia
Cơ chề thiều máu trong p> Thalassemia gồm 3 ngun nhân chính: sinh

hổng cầu khơng hiệu lực, tan máu vã không tống hợp được đũ huyết sắc tố. Tôn thương
gcn p-globin làm giám hoặc mất tống hợp chuồi p-globin. bẽn cạnh đỏ. sự tâng hoạt
động trờ lại cùa gcn y-globin vã tăng hoạt dộng gcn ờ- globin (ớ trê sau khi ra dời). Các
chuỗi này khi kết hợp với chuồi a-globin tạo HbF (a:Ỵ:). HbA; ((X;ổ2). Kha nâng vận
chuyên oxy cùa các llb bầt thưởng rất kẽm dần đến thiếu oxy tại tổ chức [3] [8] [13],
Bên cạnh dó, giâm tống hợp chuồi ơ-globin sẽ làm thừa chuồi p-globin vã ngược lại.
Các chuồi globin thừa lắng dọng trên màng hồng cầu Làm tốn thương và gây vờ hồng
cầu.Việc giam tỏng họp chuồi p-globin khiến cho chuồi a-globin tự nõ không thê tạo
thành một phân tư huyết sắc tố hồn chinh, do dó nó bị kết tua tạo thành thế vùi trong
các tẻ bào tiền thân dòng hồng cầu trong giai đoạn tỏng hợp huyết sắc tố. Nhùng thê vùi
lớn lãm phá huỳ nguyên hồng cầu. gãy ra sinh hồng cầu không hiệu lực trong tất ca các
the p-Thalasscmia (14]. Trong p-Thalassemia the nặng, phần lớn các tể bâo dầu dòng
hồng cầu bị phá huy ngay khi còn ơ trong tuy xương. Chuồi globin tự do kct hợp với
protein màng hồng cầu làm thay đối cấu trúc và chức nâng mãng hồng cằu làm hồng
càu dẻ bị dại thực bão bầt giữ ở hộ liên võng, gây tính trạng lan máu [15].
1.81

1.82
1.83
1.84

Hình 1.1. Cư ché bệnh sinh của fl-Thalassemia

Triệu chứng chính cua bệnh [C Thalassemia lã hội chứng thiếu máu và

tan máu mạn tinh, do vậy nếu không được truyền máu sớm và định kỳ. bệnh nhân sỏ bị
biến chứng biền dạng xương do tỉnh trạng tâng sinh tạo mâu q mức. Bơn cạnh dó. do
cơ thổ tăng hấp thu sát vã việc dưa một lượng lớn sắt vào cơ thể qua truyền máu đà gây
nên tính trạng quá tai sất ơ bệnh nhân 0- Thalassemia [16].
1.85
Cơ
chế
bệnh
sinh
bệnh
|}-Thalasscmia
dàn
den
thay
dối
một bất
nồng
số
độ
chi
huyết
số
xct
sắc
nghiệm
tố
Hb
cịn
cơng

có
thức
sự
thay
máu
cặn
đối
làm
VCngười
lượng
sàng,
huyết
ngồi
sấc
hồng
tổ
cầu
trung
(MCV).
bính
MCV
hồng
lã
cầu
thê
(MCH)
tích
cùa
vả
the

một
tích
hồng
trung
cầu
dược
bỉnh
tính
trung
hay
bính,
thường
giúp
(to
xác
hay
định
nhị),
kích
giá
thước
trị
hồng
MCV
cua
cầu
bính
thường
trương
thành

khoe
mạnh
từ
80-100
AL.
MCH
1.86 lả lượng huyết sắc tổ trung bỉnh chứa đựng trong một hồng cầu. giá trị MCH cùa
người trướng thành khoe mạnh lừ 28-32 pg. Dựa vào đặc diem huyết học, các chi số thè
tích trung bỉnh hồng cầu (MCV), huyết sắc tổ trung bỉnh hồng cầu (MCH). sức ben

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


1
2

tham thấu hồng cầu. và tàng HbA; được sư dụng đe sảng lọc p-Thalassemia [17],
1.1.5 Diều trị bện h Ịi- Tít a lass em ì a
1.87 Hiện nay chưa có phương pháp điều trị triệt dè bệnh [ỉ-Thalassemia. Tùy
thuộc vào thê bệnh và mức độ bệnh, bác sf sè có nhùng hướng điều trị triệu chửng
chính như tiến hành truyền máu cho các thê bệnh Thalassemia phụ thuộc truyền máu.
Ngoài ra. có thê tiến hành diều trị thai sắt và cat lách cho bệnh nhân. Phương pháp ghép
tề bão gốc tạo máu dồng loài cùng đà dược áp dụng đỗi với Thalassemia mức dộ nặng.
Phương pháp (ìen trị liệu vần đang dược tiếp tục nghiên cửu [18].
1.2. Sơ lược về Hemoglobin (Hb)
1.88 Hemoglobin (Hb) hay côn gọi lã huyết sắc tố là một protein phức hợp.
dam nhiệm nhiều chức nàng sinh học quan trụng như vận chuyến oxy từ phối đen lố
chức và mang cacbon dioxil từ tồ chức về phổi de thái ra ngoải. Hemoglobin được cẩu
tạo gồm hai phần là hem và globin. Một phân tứ hemoglobin gồm 4 dưới đơn vị. mỗi
dưới đơn vị lã một chuồi globin ket hợp với một nhãn hem. Mỗi phản tư hem có chữa

một plìân tứ Fe:*. Globin lã thành phẩn protein cùa phân tứ hemoglobin, bao gồm 4 bậc
cấu trúc, quyết định dặc tính và loại hemoglobin. Có các globin thuộc hụ a là (í. ổ. mỏi
globin nãy gồm cỏ 141 acid amin; cãc globin thuộc họ khơng « lã p. Ỵ. ổ. E, mồi globin
này gồm có 146 acid amin. Ngồi ra cịn có phân tư 2.3- DPG dược tạo ra trong quã
trinh ứioái hỏa glucose, lãm giam ái lực cua Hb với O; [3] [17] [19]. Trong quã trinh
phát triển cá thê, các loại llb thuộc họ a và khơng « có mạt ớ người bính thường tùy
theo từng giai doạn.

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


1
3

1.89
r *
aAaaa /
1.90Rún" 1.2. Câu trúc globin và thời kỳ xuât hiện ỉĩb ừ người bình thường
1.91 Loại
Hemoglobin

1.92 Cấu irủc
chuồi

1.95

1.96

Hb Gower I

1.93

62 £2

gl

1.94

Thời kỳ xuất hiện

1.97

Phôi thai 2-3 tuần, tốn tại 1-2

tháng dầu cua thai
1.98

Hb Gower n 1.99

«2

E

2

1.100 Phơi thai 2-3 tuân, tốn tại 1-2
tháng đầu cua thai

1.101 Hb Portland

1.103

S2Y2

1.102 HbF

1.104

«2ổ2

1.107 HbAl

1.108

«202

1.105 Phơi thai 2-3 ln
1.106 Thai nhi 5 ln, là Hb chu yểu ư
thai nhi
1.109 Thai nhi 6 tuần, là Hb chu u ỡ
người bính thường

1.110 HbA2

1.111

«2ỏ2

1.112 Thai nhi lúc gân sinh. Hb ờ người
binh thường

1.113

1.114
1.115 Như vậy, sau khi sinh, cơ the người bính thường chi cịn 3 loại

hemoglobin lả HbAI. HbA2 và HbF. Dưới đây là ti lệ các loại Hb (%) ớ một sổ giai
đoạn cua cá thê người bính thường
1.116 Rủng ỉ. 3. Tì lệ cúc loại ỉỉb ở các giai đoạn phát triển
1.117 Giai đoạn

1.118 HbAj(%)

1.119 HbA:(%)

1.120 HbF(%)

1.121 Sơ sinh

1.122 20-40

1.123 0?03-0.6

1.124 60-80

1.125 6 tháng
1.126 93-97
1.127 2.O-3.O
1.128 1.0-5.0
ti
1.129 Từ 1 ti

1.130 97
1.131 2.0-3.0
1.132 0.4-2.0
gen
tên
gọi.
Hụ
gen
globin
« nâng
nằm
trên
cánh
ngàn
U.
(tương
nhiễm
theo ứng
thứ
sắcvới
tự
thề
chiều
(NST)
từ16
5’
gồm
đến
33'
gcn

dọc
chức
theo
chiều
ồ, «2
và
trơ
lên
1.134 NST); hụ gen globin khơng (X, mội trong sỗ đó bao gồm gcn 0-globin, nằm trên
nhiễm sảc the (NST) 11.

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


1
4

1.135

Hirn

firrm nnni num nnrnnnnL

'ZZZZZ^B'ZZZZ/

1.136
1.137

£ Gy Ay 5 p

NST16

NST11

Hình 1.2. Vi tri'của gen a và p globin trên NST16 và //

1.138 Hb (hemoglobin) lã thành phan hoạt dộng chức nâng cua hong cầu. khi
huyết Sắc tổ ( I Ib) không đạt nồng độ cần thiết trong máu thỉ bị coi là thiếu máu. Nồng
độ Hb ờ nam là l30-160g/l. ờ nữ là 125-I45g/1 [3] [8] [17]. Tảng HbA : trong nhưng
trường họp mang gen đột biền gây bệnh p-Thalassemia là do láng mạnh ổ-globin sân
sinh lừ gcn ổ bên cạnh gen 0 bị dộl biến [i- Thalassemia. và lừ gcn ổ cua nhicm sac thê
doi diện cịn bính thưởng. Tâng HbA; còn do sự phối hợp cua mạch globin ổ với mạch
globin a. thay thế cho mạch globin [ỉ thiêu.
1.2.1. Vị trí, cấu trúc gen p globin ( HBB)
1.139 Gen HBB là gen mã hóa cho chuồi p globin nằm trẽn nhánh ngắn cua
NST sỗ II. ớ vị trí I Ipl5.5. mỗi NST chửa một gen p globin. Gcn dài 1600 cập base, mã
hóa cho 146 acid amin. gồm 3 exon và 2 intron xen kẽ [20].

Hình 1.3. Cẩu trúc và quá trình tồng hợp chuồi p globin ỊIỊ
1.140
1.141 1.2.2 Tương quan giữa dột hiển gen 1ỈBB vù bệnh // Thalassemia
1.142 Hiện nay đã phát hiện trên 200 đột biến p-Thalasscmia. phân bỗ các loại
đột biến khác nhau tủy từng khu vực. quốc gia và dàn tộc. Trong đó có khống 150 lã
đột biến điếm, còn lại là mất đoạn ngắn và một sổ loại hiềm gặp khác. Phần lớn các đột
biển dà được mị ta. nhưng trong dó cỏ chi khoáng 20 đột biến hay gặp. chiếm 80% các

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


1

5

đột biến trên gen p Thalassemia trên thể giới [21 ]. Dưới dây là một số đột biền cỏ thê
gập trên gcn [ỉ-globin:
-

Đột bicn dicm tại vùng khơi động (promoter): dột biến thay thế nucleotitde tại vị
tríTATA hoặc CACCC dẫn dền giám tổng hợp chuỗi p- globin so với bỉnh
thưởng.

-

Những dột biến vỏ nghfa (nonsense mutations): sự thay thế một nucleotit trong
exon có thê dàn đến sự tạo thành một trong ba mà kết thúc (ƯAA. ƯAG hoặc
UGA) làm cho việc dịch mà kết thúc sớm hơn so với bính thường và tạo san
phẩm [5-globin không vừng bền. bị phả húy ngay trong tế bão.

-

Những đột biền diêm xay ra ở các vị trí lầp ráp mAKN: Tuỳ thuộc v phần cua
điếm noi cịn ngun vẹn hoặc bị biển đói hỗn tồn mã dần dền - Thalassemia
hay 0 Thalassemia.

-

Những dột biến dịch khung xáy ra ở các cxon: đột biến thêm vào hoặc mất di
một hoặc vài nucleotit, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đỏi khung đọc mà di
truyền làm thay dơi san phẩm P-globin.

-

Ngồi ra. nhừng dột biến tại vị trí tiếp giáp intron- exon với cơ chế và mức độ
khác nhau cũng tạo ra kiêu hình cua bệnh p- Thalassemia. Quả trinh cắt nhùng
đoạn intron và nối nhừng đoạn cxon cùa gen p- globin dịi hơi các vị tri' cho nỗi
GT tại đầu 5’ và vị trí nhận dầu nỗi AG tại dầu 3’ của intron. Những dột biến tại
các diêm nối cỏ the sẽ giâm hoặc loại bo hốn lồn q trinh hình thành mRNA
thơng thường [13] [22].

1.3.

Các phương pháp phát hiện (lột biến gen IIBB gây bệnh p Thalassemia trên

người lành mang gcn bệnh
1.3.1. Các phương phủp chân dốn sàng lọc
1.143 Có the sàng lọc những người lành cỏ nguy cơ cao mang đột biển gen
HBB bang các chân đốn sau:
-

Tiền sư: gia đính có người bị bệnh Thalassemia.

-

Triệu chúng lâm sàng: vảng da. mệt moi....

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


1
6

-

Xct nghiệm cận lâm sàng:
1.144

+ Tống phân tích lề bão máu ngoại vi: thiều máu (Hb giam) hồng cầu nhô

(MCV < 80 ÍL). hồng cầu nhược sắc (MCH < 27pg) [5] [ 17].
1.145

+ Điện di huyết sắc tố: tâng tỳ lộ huyết sằc tố bất thưởng: HbF > 2%,

HbA; > 4%. Trường hợp nghi ngờ cỏ dột biến gây bệnh IIbE cơ I IbE > 25% [3].
1.3.2. Chắn đốn xúc định bệnh bằng các kỹ thuật sinh học phàn tư
1.146 Các xét nghiệm di truyền học phàn tư như Multiplex ARMS PCR. giái
trinh tự gen. ... lã nhừng chân đoán xác định nhầm phân tích các dột biến gen trên các
gen |i globin.
1.3.2.1. Kỳ thuật Multiplex ARMS PCR ( Multiplex Amplification
1.147 Mutation System)
1.148
diệncó
cúa
Multiplex
nhiều
alen
ARMSPCR
biến,
dược
dùng
de

sir
sàng
dụng
lọc
hiệu
sự
qua
hiện
trong
q
phan
trinh
ứng
Multiplex
phát
hiện
ARMS
dột
biền
PCR
bao
diêm.
gồm
Nhùng
mồi
bính
mồi
sư
thường
dụng

cho
mồi
thường,
biến.
khơng
Mồi
bính
khuếch
thường
đại
được
dặc
hiệu
trình
cho
tự
trình
DNA
dột
tự
biến
DNA
bính
và
ngược
chi
xuất
lại
hiện
(hình

vạch
1.4).
diện
Ncu
di
mầu
ớsán
giềng
có
kiểu
có
gcn
mỗi
dồng
dột
biển,
hợp
tứ
nếu
thi’
mầu
vạch
diện
kiều
di
gen
chứng
dị
hợp
ló

cỏ
tứ
cá
thí
ca
phấm
hai
giếng
ờ
mồi
đều
thường
xuất
vả
hiện
mỗi
dột
1.149 biên. Trong phan ứng Multiplex ARMS PCR cịn có cạp mịi nội chn nham
khuếch đại vùng gcn đích khơng có đột biển để tránh trường hợp âm tính giã do các
nguyên nhân như: quá ít hoặc quá nhiều khn DNA. chất lượng DNA khơng tốt.
khơng có một trong các thành phần cúa phân ứng PCR hoặc có mật chất ức chế phán
ứng PCR. Kỳ thuật này dược sứ dụng đê phát hiện các đột biến dà biết. Các nghiên cứu
cua Nguyền Khấc Hàn Hoan (2011) và Trằn Vân Khánh (2014) dà làm rõ kỳ thuật
Multiplex ARMS PCR phù hợp đê phát hiện các đột biến diem, cho phép phát hiện the
bất thường vã kiêu gcn dột biến. Tuy nhiên, các đoạn mồi có thê bị thối hóa vã tạo ra
những sản phấm không đặc hiệu [18) [23].
1.150
1.153

1.151

1.152

Mil

Hah tbuvau

1.154
1.157

1.155 ’ MM.'Y
5 Mồi

-Vy

1.160

1.156
4ọ< HĨI

1.158
—

1.159

—L-L

y.Mịi

1

1.161 Hình l.4.Ngun lý của kỳ thuật Multiplex ARMS- PCR
1.162

ỉ. 3.2.2. Kỳ thuật giai trình tự gen Sanger
1.163 Giai trinh tự gcn lã phương pháp xác định vị trí cua 4 loại nucleotide A

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


1
7

(Adenine), c (Cvrosine), G (Guanine), T (Thymine) trong phàn tư DNA. Năm 1977.
Frederick Sanger cùng cộng sự dà phát minh ra phương pháp giai trinh tự gen bang
enzyme với nguyên lý: sir dụng dideoxynucleotidc (ddNTP) là một phàn lư nhân tạo. có
cầu trúc tương tự như phàn từ deoxynucleotide (dNTP) tuy nhiên ở carbon số 3 cùa
dường deoxyribose không phái là nhóm hydroxyl (-OH) mã lã (-H). đê dừng việc tịng
hợp mạch bơ sung do khơng hình thành dược liên kết photphodieste [24].

1.164 <£>-<£> <Ê> oci-b^o^EMao Didooxynuclcotldo (ddNTP)

1.165
1.167

1.166 Dooxynucloolldo (dNTP)
1.168 Hình 1.S.C&U true ddNTP VÙ dNTP

1.169 ( Nguồn )
1.170

Dựa
trên
nền
tang
của
kỳ
Sanger
cố
điên,
ngày
naysáng
các
phịng
gcn
bằng
xét
nghiệm
máy
thường
Kỳ
sư
thuật
dụng
phương
Sanger
pháp
cái
tiến
giãi
sứ

đụng
dấu
phỏng
các
ddNTP
xạ
như
có
tnrữc
đánh
dầu
đày
huỳnh
dã
giúp
quang
cho
thay
việc
cho
sắp
việc
xếp
trinh
đánh
tự
được
DNA
gán
trờ

một
nên
mâu
nhanh
có
bước
chóng
sóng
và
hiệu
q
xụ
huỳnh
hơn.
Mỗi
quang
loại
khác
ddNTP
duy
nhất.
cho
phép
Hệ
thống
thực
hiện
diện
giai
di

mao
trinh
qn
tự
được
trong
sứ
dụng
phan
đè
đọc
ứng
trinh
máy
là
tự
trong
DNA
một
suốt
cách
q
tự
trinh
động.
điện
Ngun
di.
khi
tấc

có
hoạt
một
dộng
vạch
cùa
điện
di
dược
di
camera
qua
chùm
ghi
tia
nhận
laser
và
lưu
thí
lại
vạch
thành
diện
một
di
cường
sè
phát
độ

sáng
đinh
vã
sáng
độ
(peak)
này.
trong
máy
sẽ
biêu
so
dơng
dồ.
Từ
cua
biểu
các
đổ
đinh
cua
tương
các
đinh
ứng
với
cường
nhau
diêm
và

cua
phân
phương
tích
pháp
thành
này
trinh
là
phan
tự
cua
ứng
các
giai
đoạn
trình
DNA
tự
[25].
gen
có
Ưu
thê
một
thực
hãng,
hiện
từ
đó

trong
tiết
một
kiệm
ống
thời
nghiệm
gian
và
và
chi
cơng
cần
sức
điện
cua
di
người
trên
thực
dột
hiện
biến
kỳ
thuật.
trên
gcn
1
lơn
sè

được
nữa.
phát
với
ngun
hiện,
diều
lý
trên,
nãy
dẫn
hầu
đến
hết
ứng
ARMSdụng
PCR
vượt
là
phát
trội
hiện
cua
phương
ra
những
pháp
đột
Sanger
biền

mới.
so
với
Tuy
Multiplex
nhicn
chi
các
phí
phương
cao
pháp
hơn
so
khác.
với
các
kỹ
thuật
giai
trinh
tự
gen
bằng

TM/ zfci V*: 4Ả 'V.


18
18

1.171
1.172 Hình 1.6. Phương pháp giải trình tựgen Sanger hằng mày tự động
1.173 (Nguồn )

TM/
TC zfci
V*: V*: 4Ã 'V.


1.174 Chương 2: ĐÕI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cưu

1.1 Đối tượng nghiên cứu
1.175 Tiến hành nghiên cứu trên mầu máu ngoại vi cua người được chân đốn có
nguy co mang đột biến gen gây bệnh 0- Thalassemia sau khi dà có kết q xct nghiệm cận
lâm sàng (tơng phân tích te bão máu ngoại vi. xct nghiệm sinh hóa. điện di huyêt sac to) ơ
Trung tàm nghiên cứu Gen- Protein trường Đại học Y Hà Nội.
1.1.1.

Tiên chuẩn chọn mầu

1.176 Mầu máu ngoại vi cua người tham gia nghiên cứu dựa trên nhùng sàng lọc
về tiền sử gia dỉnh ( có họ hàng mẳc bệnh Thalassemia), yeu tố dịch tễ (dân tộc Kinh và
cãc dân tộc thiêu số miền Bắc Việt Nam có nguy cơ mang đột biến gen cao) cỏ thê có triệu
chứng thiều máu làm sàng, được chân đoán là thiếu máu nhược sác. hồng cầu nho ( llb
giam. MCI I < 27pg. MCV<80 flL) và có nồng dộ I lbA; > 4%).
1.1.2.

Tiêu chuẩn loại trừ

-

Mầu bị hư hóng trong q trinh lưu trừ. bao qn.

-

Dối tượng khơng dồng ý tham gia nghiên cửu.
1.2 Thời gian và dịa diêm nghiên cứu

-

Thời gian nghiên cứu: Tháng 11 nãm 2020 den tháng 5 nãm2021

- Dịa diêm nghiên cửu: Trung tàm nghiên cửu Gcn - Protein Trưởng Dại Học Y Hà
Nội
1.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1

Thiết kế nghiên cửu

1.177 Phương pháp mò ta cẳt ngang
2.3.2

Cở mầu

1.178 Cờ mẫu thuận tiện: 15 mầu máu ngoại vi
2.S.3

Sư dồ nghiên cừu

1.179
-

• Bước 1: Thu thập mầu máu ngoại vi của dối tượng nghiên cứu.

Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi.
1.180

+■ Tãch DNA bảng kit The Wizards Genomic DNA Purification cùa hàng Pl

omega.
1.181

+■ Đo nồng độ và kiêm tra độ tinh sạch cua DNA bằng phương pháp đo mật

độ quang.
-

Bước 3: Thực hiện kỳ thuật PCR khuếch dại 3 cxon của gcn HBB.
1.182

+ Khuếch đại các vùng gen với mồi dặc hiệu.

1.183

+ Kiềm tra san phẩm bang kỳ thuật điện di trên gel agarose.

-

Bước 4: Giai trinh tự 3 exon cua gen HBB.

-

Bước 5: Đục và phân tích ket qua bang phần mcm CLC Main Workbench.

1.184 2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.4.1.

Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cừu Dụng cụ

-

Pipet bán tự dộng và dầu côn các loại 1000 pL. 200pL. lOOpL. 20pL, 10pL. 2.5uL

-

Õng Eppcndorf loại 1,5 mL vã 0,2 mL

-

Cốc đong, bính thuy tinh

-

Găng tay. giấy thấm vỏ trùng, giá dựng
1.185

Sinh phẩm, hóa chất

> ỉ lịa chất lách chiết Dí\'A
-

Kit tách DNA cua hãng Promcga bao gồm: Cell Lysis Solution. Nucleic Lysis
Solution, dung dịch Protein Prcpcipitation, Isopropanol, ethanol 70%. DNA
Rehydration Solution. Proteinase K

> Hóa chất khuếch dại PCR


21

-

Nước PCR (nước cất được khư ion. không chứa bất cứ thành phần nào khác như:
DNAase. RNAase. enzyme cắt giới hạn ...)

-

GoTaqẴ Hot Start Polymcrascm(Promcga) :chứa 4 thành phần dNTP. Taq
Polymerase. MgCL. buffer, loading dye
1.186

-

> Hóa chát điện di

Dung dịch đệm THE I0X (Tris Borate EDTA ) hàng (Promega) gồm: Tris base.
Boric acid. EDTA. Khi sứ dụng dung dịch đệm TBE được pha thành đệm TBE IX.

-

Bột agarose (Promega)

-

Ethidium Bromide lOmg/ml

-

DNA Gen Ruler 100 bpDNA Ladder
1.187

Thiết bị

-

Máy ly tâm đế bân (Eppendorf Centrifuge 5424R)

-

Máy PCR Eppendorfvapo.protect (Eppendorí)

-

Máy vortex (Eppendorf Mix Mate)

-

Mảy Spindown E-centrifuge (Eppendorf)

-

Máy lấc nhiệt (Eppcndorf Thermomixer 543 7)

-

Mãy diện di EC 300XL Power Supply (Thermo)

-

Máy do quang OD Nanodrop 2000c (Thermo)

-

Càn diện tứ AB2O4 (Mettler Toledo)

-

Lị vi sóng

-

Tủ lạnh SANYO

1.188 2.4.2 Quy trìn It Itglt iẽn cứu
1.189 2.4.2.1 Quy trình thu thập và bao i/uãn mẫu
1.190 Mầu mâu tồn phần có thế tích khoang 2nd dược bao quan trong ống chứa
chất chống đông EDTA. bao quan Ở4-8°C tối đa hai tháng.
1.191 2.4.3.2 Quy trinh kỳ thuật tách chiết D.\'A lừ mầu mâu toàn phần

a. Quy trinh tách chiết DNA từ mầu máu toàn phẩn:

TM/ V*:


22
22

1.192
-

DNA được tách chiết theo kit thương mại Promcga gồm các bước sau:

Phả vờ hồng cầu
1.193

4- Hút 800p! dung dịch Cell Lysis Solution vào ống Eppendorf 1.5ml.

1.194

+■ Thêm 500pl máu tồn phần đà chống dơng vào ống trên. Vortex mạnh I

phút, u 10 phút ờ nhiệt độ phông.
1.195

+ Ly tâm 14000 vòng/phút trong vòng I phút ở 22° c.

1.196

4- Loại bõ dịch nối.

1.197

4- Lặp lại quá trỉnh này đến khi có tua trăng ( khơng thêm máu tồn phần)

-

p/iớ vờ hạch cầu
1.198

4- Thèm 300pl dung dịch Nucleic Lysis Solution vã mix bang pipet. Vortex

mạnh cho den khi lúa tc bào vờ thành các manh nhó.
1.199

4- Them 5pl proteinase K. vertex nhẹ. ũ và lác qua đêm ờ 56°c cho dền khi

tan het lua tế bảo.
1.200

4- Thêm 200pl dung dịch Protein Precipitation. Lấc nhẹ tay 30 giây rỗi ly

tâm 14000 vòng/phút trong phòng 10 phút ở 22°c
-

Tua và hòa tan DNA, loại ho càc chất dư thừa
1.201

4-1 lút 400pl dịch nôi sang ống Eppcndorf 1,5ml mới. tránh hút phai lua

protein.
1.202

4 Them 400pl Isopropanol, lấc kỹ và quan sát lua DNA

1.203

4- Ly tâm 14000 vòng'phút trong vỏng 10 phút Ư 4 C

1.204

4- Loại bo dịch nói. giữ tũa DNA

1.205

4- Thèm 500pl cồn 70 độ. Lắc 10 lần rồi ly tâm 14000 vòng/phúl trong vòng

5 phút ở 4°c.
1.206

4- Bo dịch nối. giữ tua DNA và de khô ở 56°c cho dến khi cồn bay hơi hoàn

toàn.
1.207 + Thèm 50j.ll dung dịch DNA Rchydration. ũ 56°c trong 1 giờ và bao quán
ở 4°c.

TM/
TM/ V*:
V*:

23

b. Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch DNA
-

Nguyên lý
1.208

Nguyên lý cua phương pháp này là dựa trên sự hấp thụ mạnh ánh

sáng cua cua một chất ờ một bước sóng nhất định. Nucleic Acid hấp thụ mạnh ánh
sáng tứ ngoại ờ bước sõng 260nm do sự có mật cùa hai đem phân cẩu tạo lã base purin
vả pyrimidin. Giá trị mật độ quang ờ bước sóng 260nm (OĐ 26Cwa) cùa các mầu cho
phép xác định nồng độ Nucleic Acid cùa mẳu. [26]
1.209

Đơn vị OD26Crsa tương ứng với nồng độ 50 ng/ml cho một dung dịch

DNA sợi đôi, nong độ DNA trong mầu được lính theo cơng thức :
1.210

CDXA (ng ml)= OD2Wmn X 50 X Dộ pha loãng

1.211

Đo mật độ quang ờ bước sóng 280nm (ODjsonm), ỡ bước sóng này

các protein có mức hắp thụ cao nhắt; ờ bước sóng 230nm (OD^jcnm) caibohỵdrate cỏ
mức hấp thụ cao nhất. Tuy nhiên các protein vần hẩp thụ ánh sáng ơ bước sóng 260nm

ví vậy de xác định độ tinh sạch cua DNA tách chiẻt người ta dựa vào ty lộ A 2602SỦ 'ã
A260230 Nucleic Acid tinh sạch khi:
1.212
-

I V lộ A«do/230 = 1.8 — 2.0 vã Ajdo.-jjo> 2

Thực hiện
1.213

San phẩm DNA sau tách chiết dược kiêm tra nồng dộ và dộ tinh sạch

bằng cách đo mật dộ quang trên máy đo OD Nanodrop 2000c.
c. Điện di DNA tống số đe kiếm tra chắt lượng DNA sau tách chiết
1.214
Ngồi
kiêm
trabang
nồng
độ đo
và
độ tinh
sạch
cùa
DNA
sau
khi
táchtơng
chất
chiết

lượng
bảng
phương
phương
quang,
pháp
diện
cịn
di
tiến
tỏng
hành
so.
kiểm
Điện
tra
di
DNA
chiết.
socưa
đẽ DNA
đánh
giápháp
tính
lồn
vẹn
cua
DNA
sau
tách

TM/ V*:


24

2.1 J J. Kỳ thuật PCR
a. Trinh tự các cặp mồi và kích thước san phẩm PCR
1.215

1.216

1.218 Kích
thước sàn

1.217 Trinh tự (5’-3’)

phẩm PCR
1.219 Cập
môi
1.223 HBB
A-B
1.227 Cập
mồi
1.231 HBB
C-D

1.220 Mỏi
1.221 CCAACTCCTAAGCCAGTGCC
xuôi A

1.224 Mơi
1.225 GGGAAACAGACGAATGATT
ngược B
GCA
1.228 Mói
1.229 TCCCTAATCTCTTTCTTTCAG
xi c
G
1.232 Mịi
1.233 GCTAGTTCAAACCTTGGGAA
ngược 1)
AA
1.236 Cặp môi được thiet kè sản dựa trẽn nguon báo

(bp)
1.222
1.226 781
1.230
1.235 660

1.238 1.237 http:/Aiwv.tandfonỉine.com/doi/fiỉlỉ/10.ỉ08ỉ/HEM-ỉ2002ỉõ4]
b. Vị trí cua các cập mổi khuếch đại trên gen HBB
1.239

Thành phần phán ứng PCR

1.240------------------- —■ (XON 1
1.241 La
1.242
HBBA

(XON ì------------------------------——

(XON J

1.243 HBBC
1.244

7Slbp
HBBD

1.246
1.245 *
1.247
Báng 2. /. Bủng thành phán phan ừng của một phàn ừng PCR
1.248 66Obp
1.249 rhành phẩn phan ứng
1.250 Thê lích
(ui)
1.251 Hot Taq Master Mix (2X)
1.252 5
1.253 Nước cầt (đà khư ion)
1.254 3
1.255 Mỏi xuôi (5pmol/pl)
1.256 0.
5
1.257 Môi ngược (5pmol/pl)
1.258 0.
5
1.259 DNA

1.260 1

TM/ zfci V*: -U 'V.


25

1.261 Tơng thè tích

1.262 10

TM/ zfci V*: -U 'V.