Biến nập và bước đầu phân tích biểu hiện gen ACF35H từ cây ô đầu ở cây thuốc lá

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

Thadthasine PHOMMASENG

BIẾN NẠP VÀ BƢỚC ĐẦU PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN
GEN ACF3'5'H TỪ CÂY Ô ĐẦU Ở CÂY THUỐC LÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2021


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

Thadthasine PHOMMASENG

BIẾN NẠP VÀ BƢỚC ĐẦU PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN
GEN AcF3'5'H TỪ CÂY Ô ĐẦU Ở CÂY THUỐC LÁ
Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy

THÁI NGUYÊN - 2021


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu của tơi dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy. Kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và
chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm
ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn

Thadthasine PHOMMASENG

i


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Vũ Thị Thu Thủy đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt quá trình học tập, thực
hiện nghiên cứu đề tài và hồn chỉnh luận văn.
Tơi cũng xin được trân trọng cảm ơn ThS. Trần Thị Hồng, Trường Đại học Sư
phạm Thái Nguyên luôn theo dõi và hướng dẫn chu đáo để tôi tiến hành thực nghiệm
luận văn này.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài cấp Bộ Giáo dục và Đào tạo, mã số B2020TNA-11 do TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan, Khoa Sinh học làm chủ nhiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Bộ môn Di truyền học và Công nghệ
sinh học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi và có những góp ý sâu sắc cho tôi trong thời gian học tập, thực hiện luận văn. Tôi
xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các cán bộ bộ phận đào tạo Sau đại
học, Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi hồn thành khóa học này.
Qua đây, tơi biết ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã ln động viên,
khích lệ và chia sẻ những khó khăn cùng tơi trong suốt q trình học tập và nghiên
cứu, tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp.

Tác giả luận văn

Thadthasine PHOMMASENG

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan .................................................................................................................. i
Lời cảm ơn .....................................................................................................................ii
Mục lục ........................................................................................................................ iii
Danh mục ký hiệu, các từ và chữ viết tắt...................................................................... iv
Danh mục các bảng ........................................................................................................ v
Danh mục các hình ....................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
1. Đ t vấn đề ................................................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Giới thiệu chung về cây thuốc lá ........................................................................... 3
1.1.1. Phân loại cây thuốc lá ......................................................................................... 3
1.1.2. Vai trò của cây thuốc lá ...................................................................................... 5
1.1.3. Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá .............................................................. 6
1.1.4. Các đ c điểm thực vật học cây thuốc lá ............................................................. 6
1.2. Cây Ô đầu và con đường tổng hợp flavonoid ở cây Ô đầu ................................... 7
1.2.1. Cây Ô đầu ........................................................................................................... 7
1.2.2. Con đường tổng hợp flavonoid ở cây Ơ đầu ...................................................... 8
1.3. Gen mã hóa enzyme F3’5’H và các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H .............. 10
1.3.1. Gen mã hóa enzyme F3’5’H............................................................................. 10
1.3.2. Các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H .............................................................. 10

1.4. Nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium .............................. 11
1.4.1. Vi khuẩn Agrobacterium .................................................................................. 11
1.4.2. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .......................... 14
1.5. Đánh giá sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử ........................... 16
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 19
2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị .................................................................................... 19

iii


2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 19
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................................ 19
2.1.3. Thiết bị .............................................................................................................. 19
2.2. Địa điểm và thời gian ........................................................................................... 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 20
2.3.1. Phương pháp pha môi trường nuôi cấy............................................................. 21
2.3.2. Phương pháp biến nạp gen ................................................................................ 23
2.3.3. Phương pháp tái sinh cây thuốc lá biến nạp gen............................................... 23
2.3.4. Phương pháp phân tích sự có m t của gen chuyển trong cây thuốc lá biến nạp ........... 24
2.3.5. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của gen chuyển ....................................... 26
2.4. Phương pháp phân tích số liệu ............................................................................. 26
CHƢƠNG 3.

ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................... 27

3.1. Đ c điểm của cấu trúc vector pCB301_AcF3'5'H ............................................... 27
3.2. Kết quả tạo cây thuốc lá biến nạp gen ................................................................. 28
3.2.1. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc lá
thông qua A. tumefaciens ................................................................................. 28
3.2.2. Kết quả tái sinh cây từ mảnh lá của cây thuốc lá .............................................. 30

3.2.3. Kết quả ra cây ngoài vườn ươm........................................................................ 31
3.3. Kết quả phân tích sự có m t của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở
thế hệ T0 .......................................................................................................... 34
3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ....................................................................... 34
3.3.2. Kết quả nhân gen AcF3’5’H bằng kỹ thuật PCR .............................................. 36
3.4. Kết quả phân tích sự biểu hiện của gen chuyển AcF3'5'H trên cây thuốc lá ở
thế hệ T0 .......................................................................................................... 37
ẾT LUẬN VÀ
TÀI LIỆU THAM

IẾN NGHỊ .................................................................................. 39
HẢO ........................................................................................ 40

iv


DANH MỤC

Ý HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

AS

Acetylseringone

BAP

6 - benzyladenine

bp

Base pair = c p bazơ

Cefo

Cefotaxime

CNSH

Công nghệ sinh học

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

GM

Môi trường tái sinh chồi

GM Kan 50

Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng độ 50mg/l

RM

Môi trường ra rễ

gus

β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

Kan

Kanamycin

LB

Mơi trường theo Luria và Bertani

kb

kilo base

MS

Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

MT

Môi trường

OD

Optical density = mật độ quang học

PCR

Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase

RNA

Ribo Nucleic Acid

IBA

Indole_3_butiric acid

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1.

Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) ........................................ 21

Bảng 2.2.

Môi trường nuôi cấy cây thuốc lá ........................................................... 22

Bảng 2.3.

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn A.tumefaciens ........................................ 22

Bảng 2.4.

Trình tự c p mồi nhân gen AcF3’5’H ..................................................... 25

Bảng 2.5.

Thành phần phản ứng PCR ..................................................................... 25

Bảng 2.6.

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ............................................................. 25

Bảng 3.1.

Kết quả biến nạp cấu trúc 35S_AcF3’5’H_cmyc_KDE trong vector
chuyển gen pCB301_AcF3’5’H.............................................................. 33

v


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.

Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)...................................................... 4

Hình 1.2.

Con đường sinh tổng hợp flavonoid [14]................................................ 9

Hình 1.3.

Cấu trúc khơng gian 3D của protein F3’5’H ........................................ 10

Hình 1.4.

Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ A.tumefaciens [41]. ...................... 15

Hình 1.5.

Các mức độ đánh giá sinh vật chuyển gen ............................................ 17

Hình 2.1.

Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen vào cây thuốc lá .................................... 20

Hình 3.1.

Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301_AcF3’5’H. ....................... 27

Hình 3.2.

Hình ảnh mơ tả q trình chuẩn bị và biến nạp gen vào cây thuốc lá .......... 29

Hình 3.3.

Hình ảnh mơ tả q trình tái sinh cây ................................................... 31

Hình 3.4.

Hình ảnh cây thuốc lá chuyển gen in vitro ngồi vườn ươm ................ 32

Hình 3.5.

Hình ảnh kết quả điện di DNA tổng số ................................................. 35

Hình 3.6.

Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen
AcF3’5’H từ các cây thuốc lá chuyển gen T0. ..................................... 36

Hình 3.7.

Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả RT-PCR khuếch đại gen
AcF3’5’H (cDNA) từ các cây thuốc lá biến nạp. ................................. 37

vi


MỞ ĐẦU
1. Đ t v n ề
Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) là những vị thuốc quý, được dùng
phổ biến trong y dược học cổ truyền phương Đơng. Củ Ơ đầu chứa nhiều loại dược
chất quý, trong đó có flavonoid. Flavonoid là chất chuyển hóa thứ cấp liên quan đến
một số khía cạnh của sự phát triển và bảo vệ thực vật. Chúng tạo màu cho hoa và quả,
tạo điều kiện cho hạt và phấn phát tán, đồng thời góp phần giúp cây trồng thích nghi
với các điều kiện mơi trường như áp lực lạnh ho c tia cực tím, và sự tấn công của
mầm bệnh. Flavonoid là chất quan trọng có tác dụng chống oxy hóa, chống tăng sinh
tế bào và đ c biệt là chống ung thư. Những năm gần đây các nhà khoa học trên thế
giới quan tâm tới nhóm chất flavonoid trong chi Aconitum nhằm phát triển các dược
phẩm theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng một số lồi thuộc chi này trong
phịng và điều trị bệnh. Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid trong Ô đầu lại rất thấp, do
vậy, việc lựa chọn công nghệ làm tăng hàm lượng flavonoid trong củ Ô đầu là vấn đề
đ t ra cho nghiên cứu dược chất từ Ơ đầu.
Con đường sinh tổng hợp flavonoid, có nhiều loại enzyme tham gia. Trong đó,
có hai loại enzyme monooxygenase thuộc họ P450 tham gia, đó là flavonoid 3’hydroxylase (F3’H) và flavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H). Enzyme F3’5’H giữ vai
trò đ c biệt quan trọng trong việc tạo thành sản phẩm cuối của con đường sinh tổng
hợp flavonoid ở thực vật. Vì vậy, khi tăng hàm lượng và hoạt tính của enzyme

F3’5’H sẽ làm tăng tổng hợp và tích lũy hàm lượng flavonoid.
Cây thuốc lá là thực vật 2 lá mầm, có thời gian phân hóa từ mơ đến cây hoàn
chỉnh tương đối ngắn. Thuốc lá cũng được lựa chọn làm cây mơ hình để chuyển
nhiều gen có giá trị với cây trồng. Chính vì vậy, nghiên cứu chuyển gen mã hóa
flavonoid 3' 5' hydroxylase (F3’5’H) phân lập từ cây Ô đầu vào cây thuốc lá làm cơ
sở để tạo cây Ơ đầu chuyển gen có hàm lượng flavonoid cao là rất cần thiết. Xuất
phát từ lý do trên chúng tôi chọn đề tài “Biến nạp và bước đầu phân tích biểu hiện
gen AcF3'5'H từ cây Ơ đầu ở cây thuốc lá”.

1


2. Mục tiêu nghiên cứu
Biến nạp và phân tích được sự biểu hiện gen AcF3'5'H ở mô lá cây thuốc lá
biến nạp.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu đ c điểm của cấu trúc vector pCB301_AcF3’5’H;
3.2 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen chuyển AcF3'5'H vào mô lá thuốc
lá thơng qua Agrobacterium tumefaciens;
3.3. Nghiên cứu xác định sự có m t của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR
3.4. Nghiên cứu sự biểu hiện hiện gen bằng kỹ thuật RT-PCR.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây thuốc lá
1.1.1. Phân loại cây thuốc lá
Theo Reed S. M. (1993),cây thuốc lá được phân loại thuộc giới thực vật
(Plantae), ngành thực vật hạt kín (Angiosperms), lớp 2 lá mầm (Eudicots), bộ Cà

(Solanales), họ Cà (Solanaceae), chi Thuốc lá (Nicotiana), loài Thuốc lá (Nicotiana
tabacum L) [27].
Một số loài trong họ Cà được trồng rộng rãi như khoai tây (Solanum), cà chua
(Lycopersium), ớt (Capsium), cà độc dược (Datura) và thuốc lá (Nicotiana). Đ c
trưng của các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như
solanin, atropin, scopalamin, nicotine... Trong họ này cũng có những lồi có tầm quan
trọng với tồn cầu, ví dụ như khoai tây (Solanum tuberosum). Củ khoai tây là nơi
chứa lượng cacbohydrat rất lớn rất có giá trị khơng chỉ với chính bản thân cây này mà
con người cũng sử dụng để thu nạp thêm năng lượng. Tuy nhiên, củ khoai tây có thể
trở thành chứa chất độc nếu nó đang nảy mầm. Các vùng vỏ có màu xanh chỉ ra rằng
củ khoai tây đang chuẩn bị nảy mầm, đồng thời nó cũng là chỉ thị của sự có m t của
các chất như chaconin hay solanin. Các hợp chất glycoside này khi tích lũy nhiều
trong củ có thể gây ngộ độc cho con người. Một số chi thì quả là nguồn cung cấp dinh
dưỡng đáng kể ví dụ như cà chua, cà tím (cà dái dê) hay cà bát, cà pháo ho c ớt là
nguồn thực phẩm khá quen thuộc của người dân Việt Nam [38].
Chi Nicotiana có 50-70 lồi, đa số là dạng thân cỏ, một số dạng thân đứng, hầu
hết là các dạng dại phụ. Căn cứ vào hình thái, màu sắc của hoa người ta phân chia
thành 4 loại chính. Theo đó, lồi Nicotiana tabacum L. có hoa màu hồng hay đỏ tươi.
Đây là loại phổ biến nhất chiếm 90

diện tích thuốc lá trên thế giới. Lồi thứ 2 có tên

là Nicotiana rustica L. có hoa màu vàng, chiếm khoảng 10

diện tích thuốc lá trên

thế giới. Lồi Nicotiana petunioide L. có hoa màu trắng, phớt hồng hay tím. Thường
chỉ có trong vườn thực vật phục vụ nguồn dư trữ gen cho lai tạo, ít được dùng trong
sản xuất. Lồi thứ 3 Nicotiana polidiede L. có hoa màu trắng. Lồi này cũng ít được
dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vườn thực vật học của một số quốc gia.

3


Hình 1.1. Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.)
(Nguồn: [38]
Trên thế giới, cây thuốc lá được trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh tác
khoảng 2.500.000 ha, Châu Mĩ là 1.600.000 ha và Châu Phi khoảng 326.000ha với
nhiều loại thuốc lá khác nhau. Trong đó, giống thuốc lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùng
trồng thuốc lá cho chất lượng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nước Mĩ, Cu
Ba, Ấn Độ [37]. Tại Việt Nam cây thuốc lá được canh tác từ Bắc đến Nam. Tuy
nhiên cũng có nhiều ở các vùng trọng điểm như: Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực
phía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai và Đắc Lắc (khu vực miền Trung), Ninh Thuận (khu
vực Tây nguyên) và Tây Ninh (khu vực phía Nam) [37].
Chi Nicotiana được chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66 lồi trong
đó 45 lồi có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1 loài ở Châu Phi.
Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là
cây bụi thân gỗ. Trong số 66 lồi thuốc lá, có 2 lồi chưa tìm thấy ở dạng hoang dại
nhưng lại được trồng phổ biến làm thuốc lá là Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N.
Rustica [27].

4


1.1.2. Vai trò của cây thuốc lá
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây cơng nghiệp ngắn ngày có tầm
quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ đối với trên 33 triệu
nông dân của trên 120 quốc gia, mà cịn cho cả tồn bộ nền công nghiệp - từ các nhà
máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả hệ thống phân phối tiêu
thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư nông nghiệp phục vụ cho cây
thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [9], [11]... Với tổng diện tích trồng trọt

khoảng 4,0-5,5 triệu ha trải khắp từ 60o vĩ Bắc đến 40o vĩ Nam và tổng sản lượng
nguyên liệu thu được khoảng 6,5-8,5 triệu tấn(trong đó khoảng 3,5-4,5 triệu tấn thuốc
lá vàng; khoảng 0,6-1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental;
còn lại là các loại khác để sản xuất khoảng 6.000 tỷ điếu hàng năm [12], [32].
Loài N. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội (Dihaploid =
4n), có biến động lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc đóng lá so với thân, kiểu tai
cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc trên đỉnh sinh trưởng, hoa dài
khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng đến đỏ (N. tabacum) hay màu vàng đến
vàng hơi xanh (N. rustica). Hoa thường tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn
đến 95%. Mỗi cây có thể cho 200-400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000
-4000 hạt. Trong hạt chứa 32-42% dầu (chủ yếu là linoleic acid và oleic acid), 2030% protein. Trong 1 gam hạt có từ 10.000-15.000 hạt và hạt có khả năng sống rất
lâu [9], [11], [12].
Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm chính
là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thế
giới. Ngoài ra, thuốc lá cịn được sử dụng vào một số mục đích khác như: Trồng
nhóm Nicotiana rustica để chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ 4-5

để sản xuất

thuốc trừ sâu Sulfat nicotin. Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất được sclareol và 13 episclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ đậu. Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng
cho công nghiệp dược phẩm. Hạt thuốc lá chiết xuất 34-40

dầu phục vụ trong công

nghiệp, sử dụng trong thực phẩm. Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao. Hoa
chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá. Một số phát hiện mới hiện nay, các
nhà nghiên cứu đã kết luận thuốc lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin.

5

Protein thuốc lá chứa nhiều amino acid quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cả
phomat, protein trong sữa [1].
Cây thuốc lá có thời gian phân hóa từ mơ đến cây hồn chỉnh tương đối ngắn.
Vì vậy ở nhiều phịng thí nghiệm, cây thuốc lá thường được dùng làm cây mô hình để
chuyển gen trước khi chuyển gen vào cây đích.
1.1.3. Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá
Trong lịch sử, cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở châu Mỹ từ hơn 6000 năm
trước công nguyên và được sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm thuốc chữa bệnh
[9], [12]. Thuốc lá là lồi cây trồng có nguồn gốc Nhiệt đới và Á nhiệt đới, hương vị
đ c biệt của nó đã được biết đến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách đây trên hai nghìn năm
và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [9], [11].
Lịch sử viết về cây thuốc lá bắt đầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi
Christopher Columbus đ t chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn Độ Dương. Các
thổ dân ở đó đã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm quyến rũ khi
chúng được châm hút để mời đoàn thám hiểm [9], [11].
Người Tây Ban Nha bắt đầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với nguồn
hạt giống từ Mexico và sau đó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hịn đảo lân cận
khác. Trồng trọt thuốc lá bắt đầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau đó phát triển sang
Guiana, Brazil [11]. Và dần dần phát triển trên các châu lục khác. Một số tài liệu
đáng tin cậy cho rằng thuốc lá được trồng từ thời vua Lê Thần Tông (1660) bằng
nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha. Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở
Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia Định, tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc
lá điếu bắt đầu được sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này. Năm 1935, giống thuốc
lá vàng sấy Blond cash đầu tiên được du nhập và trồng thử ở An Khê, đến năm 1940
trồng thử ở Tuyên Quang, Ninh Bình... [12].
1.1.4. Các đặc điểm thực vật học cây thuốc lá
1.1.4.1. Rễ thuốc lá
Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp
thu. Ngoài ra, thuốc lá cịn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, phần trên sát m t đất. Rễ trụ

được hình thành từ phôi rễ. Rễ nhánh được phát sinh từ trục của rễ cái, thường có độ

6


xiên 30- 40o. Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh, có nhiệm vụ cung cấp
nước và dinh dưỡng cho cây. Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát
gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi độ ẩm khơng khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày đ c
ở lớp đất 0-30 cm, phát triển theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp
nicotin. Nicotin được vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá [6].
1.1.4.2. Thân cây
Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân trịn, chiều cao thân
cây có thể đạt từ 1-3 m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá. Đường kính thân
đạt 2-4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách. Có 2 loại chồi
nách: chồi nách chính và chồi nách phụ [6].
1.1.4.3. Lá thuốc lá
Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay đổi tuỳ
theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip,
hình mũi mác. Độ dày, màu sắc lá có thể thay đổi. Lớp ngồi của biểu bì có tầng
cutin trong suốt và có lớp phấn sáp. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu
trúc lá quyết định độ dày mỏng, độ đàn hồi của lá thuốc. Ở trên m t lá cịn có nhiều
tuyến lơng đa bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến này chứa nhựa,
hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín. Trên m t lá có gân chính và
nhiều gân phụ [6].
1.2. Cây Ô ầu và con ƣờng tổng hợp flavonoid ở cây Ô ầu
1.2.1. Cây Ô đầu
Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) chứa dược chất aconitin thuộc loại
thuốc độc bảng A, có độc tính cao nhưng vẫn được cho là những vị thuốc quý, được
dùng phổ biến trong y dược học cổ truyền phương Đông [13]. Những năm gần đây
các nhà khoa học trên thế giới quan tâm tới nhóm chất flavonoid trong chi Aconitum

nhằm phát triển các dược phẩm theo hướng hiện đại, nâng cao hiệu quả sử dụng một
số lồi thuộc chi này trong phịng và điều trị bệnh. Nhiều flavonoid đã được phân lập
và thử hoạt tính sinh học [16]. Flavonoid là chất chống oxy hóa polyphenol được tìm
thấy tự nhiên trong thực vật, có các hoạt động dược lý quan trọng, bao gồm tác dụng
chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư. Ở Việt Nam, cây Ơ đầu được tìm thấy
7


trong tự nhiên tại các địa phương như: Nghĩa Lộ (Yên Bái), Hà Giang, Lai Châu, Lao
Cai và được trồng thu củ ở Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu từ những năm 70 của thế kỷ
XX [13]. Hiện nay, Ô đầu được trồng nhiều ở huyện Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang)
[8]. Trong báo cáo phân tích hàm lượng flavonid tồn phần trong Ơ đầu thu ở Quản
Bạ, Hà Giang tính theo quercetin bằng phương pháp đo quang là rất thấp, chỉ đạt
1,60% [20], do vậy cách tiếp cận nghiên cứu làm tăng hàm lượng flavonid trong Ô
đầu được đ t ra để cải thiện hàm lượng dược chất quan trọng này trong cây Ô đầu.
Đ c điểm về cấu trúc vòng B của flavonoid là yếu tố quyết định chính của hoạt
động chống oxy hóa của flavonoid. Trong con đường sinh tổng hợp flavonoid, kiểu
hydroxyl hóa của vịng B được xác định bởi hai loại enzyme monooxygenase thuộc
họ P450, đó là flavonoid 3’-hydroxylase (F3’H) và Flavonoid 3' 5' hydroxylase
(F3’5’H). Hydroxyl hóa vị trí 5’ bởi F3’5’H là phản ứng đ c biệt quan trọng, xác định
sản phẩm cuối trong con đường sinh tổng hợp flavonoid ở thực vật [34].
F3’5’H là enzyme chìa khóa tham gia vào q trình tổng hợp các hợp chất
flavonoid. Sự tăng hoạt động của F3'5'H cho phép tổng hợp anthocyanin và các loại
flavonoid khác [30]. Vì vậy, tăng cường biểu hiện gen F3’5’H sẽ làm tăng hàm lượng
và hoạt tính enzyme F3’5’H và sẽ làm tăng tích lũy hàm lượng flavonoid trong cây Ơ
đầu. Chính vì vậy, gen Aconitum carmichaelii F3’5’H (AcF3’5’H) được chọn làm đối
tượng tác động và kỹ thuật chuyển gen được áp dụng nhằm làm tăng hàm lượng
flavonoid trong chiến lược tạo cây Ơ đầu có hàm lượng dược chất cao.
1.2.2. Con đường tổng hợp flavonoid ở cây Ô đầu
Con đường sinh tổng hợp flavonoid là một trong những lĩnh vực được nghiên

cứu nhiều nhất của các hợp chất phenolic ở thực vật. Flavonoid được chia thành các
phân nhóm (flavanone, flavon, flavonol, leucoanthocyanidin, anthocyanin và
isoflavonoid) [28]. Hợp chất flavonoid được tổng hợp theo con đường
phenylpropanoid, đây chính là con đường tổng hợp các hợp chất thứ cấp chủ yếu của
thực vật bậc cao (Hình 1.2).

8


H nh 1.2. Con đường sinh tổng hợp flavonoid [14].
Nguyên liệu đầu tiên là amino acid L-phenylalanine (L-Phe) ho c trong vài
trường hợp là L-tyrosine (L-Tyr) được chuyển hóa hành 4-coumaroyl CoA (ho c một
este thiol tương ứng với sự xuất hiện của 4- hydroxycinnamate khác). Sau đó, những
este này được sử dụng như là tiền chất để tổng hợp các hợp chất như: flavonoid,
lignin, lignan, coumarin, furanocoumarin và stilbene [2]. Các giai đoạn của con
đường phenylpropanoid được xúc tác bởi hệ thống các enzyme chủ chốt như:
phenylalanine ammonia- lyase (PAL), cinnamate 4-hydroxylase (C4H), 4-coumarate
CoA ligase (4CL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavone
synthase II ((FNS II), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonol synthase (FLS),
dihydroxyflavonol 4-reductase (DFR), leucoanthocyanidin oxygenase (LDOX),
isoflavone synthase và isoflavone reductase (IFS), các enzyme này được mã hóa bởi
hệ thống gen tương ứng [14]. Sơ đồ hình 1.2 cho thấy F3’5’H và F3’H là hai loại
enzyme tham gia vào các phản ứng để hình thành các loại flavonoid.

9


1.3. Gen mã hóa enzyme F3’5’H và các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H
1.3.1. Gen mã hóa enzyme F3’5’H
Theo nghiên cứu của Gracia Zabala và đtg (2006), gen AcF3’5’H được phân

lập từ cây Ơ đầu có 1,521 bp mã hóa 506 amino acid. Protein F3’5’H là flavonoid3',5'-hydroxylase có vùng Cytochrome P450 với 501 amino acid. Cấu trúc không gian
của protein F3’5’H của cây Ô đầu gồm 9 chuỗi alpha và 3 chuỗi beta (Hình 1.3-A).
Trình tự gen AcF3’5’H phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang cũng có 1,521 bp mã hóa
506 amino acid. So với trình tự amino acid suy diễn từ gen F3’5’H mang mã số
JN635708.1 trên GenBank, protein suy diễn từ đoạn mã hóa của gen AcF3’5’H phân
lập từ cây Ơ đầu Quản Bạ, Hà Giang có sự sai khác ở 7 amino acid ở các vị trí 246,
280, 317, 325, 459, 481, 505. Cấu trúc khơng gian 3D của protein F3’5’H suy diễn từ
gen AcF3’5’H phân lập từ cây Ơ đầu Hà Giang (Hình 1.3B) [15].

B

A

H nh 1.3. Cấu trúc không gian 3D của protein F3’5’H
(A) Protein F3’5’H được thiết lập từ trình tự amino acid của protein F3’5’H mang mã số
AEY80043.1.
(B) Protein suy diễn từ gen AcF3’5’H phân lập từ cây Ô đầu Hà Giang [19].

1.3.2. Các nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H
Cho đến nay mới chỉ có một số ít nghiên cứu biểu hiện gen F3’5’H ở một vài
loài thực vật như cây chè (Camellia sinensis).Theo nghiên cứu của Su Young Lee và
đtg (2016), khi bảy cây chè được chuyển gen ClF3′5'H ra hoa có sự thay đổi về màu
sắc: m t trên của ống tràng hoa chuyển từ đỏ sang đỏ sẫm, m t trong của ống tràng

10


hoa chuyển từ đỏ tím sang đỏ tím sẫm ho c từ màu tím và màu của đầu nhụy chuyển
từ vàng xanh sang tím. Bên cạnh đó, phân tích PCR định lượng phiên mã ngược đã
chỉ ra rằng sự biểu hiện của gen ClF3′5'H chuyển đã góp phần vào sự biến đổi kiểu

hình ở bảy cây chuyển gen ClF3′5′H [19]. Theo nghiên cứu của Kanako Ishiguro và
đtg (2012), các enzyme flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) và flavonoid 3 ', 5'hydroxylase (F3'5'H) đóng một vai trị quan trọng trong hình thành màu sắc hoa.
F3'5'H cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các anthocyanins mang lại màu tím ho c
xanh lam cho hầu hết các lồi thực vật [17]. Đối với cây Ơ đầu hiện tại chưa có báo
cáo nào về kết quả nghiên cứu biểu hiện gen AcF3’5’H.
1.4. Nghiên cứu chuyển gen thơng qua vi khuẩn Agrobacterium
1.4.1. Vi khuẩn Agrobacterium
Có hai nhóm phương pháp chuyển gen là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen
gián tiếp. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật
là vi khuẩn A. tumefaciens Chi Agrobacterium là nhóm vi khuẩn Gram âm, gây ra các
khối u ở những vị trí khác nhau trên cây. Theo đó, Khối u xuất hiện ở rễ là do vi
khuẩn Agrobacterium zhirogenes. Khối u xuất hiện trên thân cây là do vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens. Khối u xuất hiện trên cây dâu đất, cây mâm xôi… là vi
khuẩn Agrobacterium rubi.
Chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens được nghiên cứu từ những năm 1960
-1970. Việc phát hiện ra A.tumefaciens có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu
những năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng của
công nghệ sinh học thực vật với những ưu điểm nổi trội. Đó là số bản sao của gen
biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp và ổn định, ít hình thành thể khảm, kỹ
thuật đơn giản dễ thực hiện, khơng địi hỏi thiết bị đắt tiền. Phương pháp này đã khắc
phục được những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp, như
thường thu nhận được cây trồng có nhiều bản sao của một gen, DNA ngoại lai không
bền vững và ổn định trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, nhiều thể khám và giá
thành cao [10].
Phương pháp gián tiếp đã khắc phục được những hạn chế chủ yếu của các
phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận được cây trồng có nhiều bản

11

sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật,
tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu được những cây mang thể khảm nghĩa là
chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây...
Đ c biệt là khi nhược điểm của A. tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây hai lá
mầm được khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và
được ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
ngày càng gây được sự quan tâm và dần trở thành một phương pháp chuyển gen được
ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới.
Chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens được xem là phương pháp
có nhiều ưu điểm nhất, nhất là đối với cây hai lá mầm, dựa vào khả năng chuyển gen
tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium. Vector dựa trên plasmid Ti của
Agrobacterium là hệ thống tốt nhất cho chuyển gen thực vật bởi sự đơn giản, hiệu
suất cao của sự chuyển và chèn chính xác gen chuyển với một bản chèn copy, tỷ lệ
câm gen thấp và khả năng chuyển được những đoạn DNA dài [10], [33].
Pal và đtg (1991) là những người đầu tiên thu được những cây chuyển gen trên
môi trường chọn lọc kanamycin từ lá mầm V. radiata ủ với A. Tumefaciens [23]. Cây
chuyển gen được xác nhận bằng kỹ thuật dot blot. Tuy nhiên, khơng có bằng chứng
nào được chỉ ra cho sự di truyền ổn định của gen chuyển. Phogat và đtg (1999) đã tái
sinh các mô sẹo chuyển gen trên môi trường chọn lọc kanamycin (100mg/l) từ các
mô lá non được đồng nuôi cấy với A. Tumefaciens [24]. Các mô sẹo chuyển gen được
tìm thấy là kháng với kanamycin 750mg/1, đã biểu hiện hoạt tính B-glucurosidase và
chỉ ra sự chèn gen nptll bằng phân tích Southern blot. Tuy nhiên, khơng thể được các
cây chuyền gen từ mô sẹo. Jaival và đtg. (2001) đã thu được các cây chuyển gen từ
các mẫu mô nách lá mầm ủ với Agrobacterium trên môi trường chọn lọc có
kanamycin đạt tỷ lệ 0,9 . Phân tích phân tử các cây chuyển gen đã chỉ ra sự dung
hợp gen chuyển vào hệ gen của cây chủ và gen chuyển được biểu hiện, nhưng khơng
có số liệu về sự di truyền của gen chuyển đến thế hệ sau [18], Mahalakshmi và đtg
(2006) đã phát triển cây đậu xanh chuyên gen từ các mẫu lá ban đầu trên môi trường
chọn lọc hygromycin và đạt tỷ lệ 2 . Sự chèn gen chỉ thị ở thế hệ TO và T1 đã được
chứng minh [21].

12


Sản xuất đậu xanh thường bị ảnh hưởng bởi côn trùng gây hại khác nhau. Vì
vậy, chọn tạo giống bằng kỹ thuật chuyển gen đã thu được các kết quả đáng ghi nhận.
Suranippong (2002) thực hiện một thử nghiệm để chuyển gen từ mô đậu xanh từ 2
chủng vi khuẩn khác nhau là A. rhizogenes K599 và A. tumefaciens EHA 105 mang
plasmid DCAMBIA 1301 chứa gen Oxidase cholesterol (Choa), mã hóa một protein
diệt cơn trùng, hoạt động mạnh chống lại ấu trùng một quả bông [25]. Tazeen và
Mirza (2004) đã nghiên cứu các nhân tố khác nhau để tối ưu hóa q trình biến nạp
gen vào cây đậu xanh (V. Radiata) nhờ A. tumefaciens chủng C58C1 mang vector nhị
thế p35SGUSINT chứa gen chỉ thị nptlI. Tái sinh mô sẹo đã được sàng lọc bởi gen
gus trong môi trường chọn lọc có chứa kanamycin và ổn định biểu hiện đạt tới 70

ở

pH 5,8 sau 3 ngày kể từ ngày đồng nuôi cấy [29].
Việc thiếu một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và đáng tin cậy cho sự phát triển
của cây đậu xanh in vitro đã làm ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen ở đậu xanh và
được quan tâm nghiên cứu. Mahalakshmi và đtg (2006) đã thu thập những cây đậu
xanh chuyển gen đầu tiên, sau đó phát triển một kiểu gen độc lập, tần số cao khi tái
sinh cây từ mẫu lá chính [21]. Cây chuyển gen kháng hygromycin này có hình thái
tương tự như cây nảy mầm từ hạt. Sự dung hợp của gen chuyển trong cây chuyển gen
và di truyền ổn định cho thế hệ sau đã được khẳng định thơng qua phân tích PCR và
lại Southern.
Thành cơng tạo cây đậu xanh chuyển gen có kiểu hình bình thường có khả
năng kháng sâu được báo cáo lần đầu tiên bởi Saini và đtg (2007) [31]. Các tác giả
thực hiện lây nhiễm nhờ A. tumefaciens EHA105 qua nách lá mầm nhờ mang gen mã
hóa protein ức chế α-amylase phân lập từ cây Phaseolus vulgaris, kết quả thu được

các cây chuyển gen thông qua tái sinh chổi trực tiếp. Gen ức chế α-amylase cũng
được kiểm tra bằng phản ứng Southern blot. Sự dung hợp ổn định và sự biểu hiện của
gen bar trong cây ở thế hệ 10 được kiểm tra bằng PCR và lại Southern. Trong số các
điều kiện khác nhau, gây tổn thương các mẫu biến nạp, sử dụng acetosyringone và
kháng sinh chọn lọc trong đồng nuôi cấy đóng vai trị quan trọng để đạt được hiệu
suất chuyển gen là 7,81 .

13


1.4.2. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Theo Smith và Townsend (1907), A. tumefaciens nằm trong hệ thống phân loại
như sau:
Giới

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Alpha Proteobacteria

Bộ:

Rhizobiales

Họ:

Rhizobiaceae

Chi:

Agrobacterium

Lồi:

A. tumefaciens [40]

A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau đó sử
dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho
chúng. A. tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân,
gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây-crown gall disease), khi đó các tế bào khối
u ở thực vật có gắn một đoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân tích khối u cho thấy trong
khối u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octopine goi chung là
opine. Các chất này khơng hề có trước đó và khơng hề có ở cây trồng thông thường.
Như vậy vi khuẩn đã truyền vào cây qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây
và tác nhân này có bản chất là vật chất di truyền.
Các nghiên cứu chuyển gen thông qua A. tumefaciens đều thực hiện chuyển
gen qua vết thương.

14


H nh 1.4. Mơ hình chuyển gen gián tiếp nhờ A.tumefaciens [41].
Plasmid của vi khuẩn khác được cắt T-DNA bằng enzyme giới hạn, DNA
ngoại lai được cắt bởi cùng enzyme, DNA ngoại lai được chèn vào T-DNA của
plasmid, plasmid được chèn vào lại vi khuẩn, vi khuẩn được dùng để chèn T-DNA

mang gen ngoại lai vào NST của tế bào thực vật.
Một số thành tựu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen ở cây thuốc lá:
Gen GmCHI1A là viết tắt của cụm từ Glycine max chalcone isomerase 1A.
Gen GmCHI1A được phần là từ mRNA của cây đầu tương có kích thước 657
nucleotide, mã hóa 218 amino acid được thiết kế thành vector chuyển gen trong
A.tumefaciens để truyển vào cây đâu tương nhăm nâng cao hàm lượng isoflavone
trong mầm hạt đậu tương [35]. Chuyển gen GmCHI1A vào cây thuốc lá thông qua vi
khuẩn A.tumefaciens là mơ hình chuyển gen hiệu quả để thực hiện chuyển gen vào
cây đậu tương của nhóm tác giả Lê Thị Hồng Trang và đtg thực hiện năm 2019 [7].
Gen gus mã hóa cho enzyme β-glucuronidase được phân lập từ chủng E.coli
RA201. Enzyme β-glucuronidase là enzyme thủy phân xúc tác cho sự phân giải các
β-glucuronide tạo sản phẩm phân giải có màu xanh lam đ c trưng, dễ nhận biết. βglucuronidase thường dùng dùng nhất trong phản ứng để nhận biết sự tổn tại của gen
gus là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc
không màu dưới tác động của enzyme β-glucuronidase sẽ chuyển sang màu xanh lam.
Nhờ đ c điểm này, mà các nhà khoa học đã thiết kế gen gus vào các vector chuyển
15


gen để làm chỉ thị dễ nhận biết ở mô, tế bào thực vật mang gen chuyển. Tác giả Vì
Thị Xuân Thủy và đtg đã thành công trong việc chuyển gen gus vào phôi non ở giống
ngô LVN99 nhờ vi khuẩn A.tumefaciens. Đối với phôi non của giống ngô LVN99 thì
hiệu quả biến nạp gen gus cao nhất khi nồng độ vi khuẩn A. Tumefacciens thích hợp
ở giá trị OD660nm=0,8, thời gian nhiễm khuẩn tối ưu là 30 phút, bổ sung
acetosyringone 150 µM, tuổi phơi từ 10-12 ngày tuổi (kích thước 0,9-1,3 mm) tối ưu
cho khả năng tiếp nhận gen và sự tái sinh. Ngưỡng chọn lọc kháng sinh kanamycin
đối với phôi chuyển gen là 50mg/l [5].
GmDREB6 là viết tắt Glyine max Dehydration- Responsive Element Binding.
Gen GmDREB6 có chức năng kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chống chịu các
yếu tố bất lợi phi sinh học [34]. Gen GmDREB6 dược phân lập từ mRNA của cây đậu
tương và thiết kế thành vector [22] pBI121_GmDREB6 chuyển vào cây đậu tương

giống đậu tương ĐT22 nhờ vi khuẩn A.tumefaciens [3].
1.5. Đánh giá sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Trong sinh học, các phân tử có giá trị trong nghiên cứu được chia ra thành
nhiều loại căn cứ vào bản chất hóa học của chúng. Sự ra đời của cấu trúc DNA nhờ
Oatson và Cric (1953) là tiền đề trong nghiên cứu sinh học phân tử. Cùng với đó, các
phân tử như RNA, protein…cũng là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học.
Đánh giá sinh vật chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử có nhiều mức độ
khác nhau. Mức độ thứ nhất xác định sự có m t của gen trong tế bào cây chuyển gen
được tiến hành bằng kỹ thuật PCR, với c p mồi đ c hiệu của gen chuyển và DNA
dòng cây cần kiểm tra. Xác định gen chuyển được gắn vào hệ gen cây tái sinh hay
không phải thực hiện phép lai phân tử Southern mà mẫu dò là đoạn gen chuyển được
đánh dấu huỳnh quang còn DNA nhân cao phân tử được tách từ mô của cây chuyền
gen. Xác định gen chuyển có được phiên mã thành mRNA hay khơng, tức là có được
bộ máy sinh tổng hợp protein chấp nhận hay không được thực hiện bằng kỹ thuật lai
Northern giữa mẫu dò là đoạn DNA của gen đánh dấu huỳnh quang và RNA tồn
phần của mơ cây chuyển gen. Và bước cuối cùng là xác định gen chuyển có biểu hiện
và tạo ra sản phẩm cuối cùng của nó là protein bằng kỹ thuật lai Western giữa protein
của cây chuyển gen và kháng thể đ c hiệu với protein đó được tinh sạch từ nguồn

16