Khóa luận đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết cây bơ (persea americana mill )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

HOÀNG THỊ THÚY

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ

(Persea americana Mill.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

an
dP

ha
rm
ac
y

,V
NU

KHOA Y- DƯỢC

HOÀNG THỊ THÚY

fM

ed
ici
ne

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM
ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ

Sc
ho
ol
o

(Persea americana Mill.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Co
p

yri
g

ht

@

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2014.Y
Người hướng dẫn 1:

ThS. ĐẶNG KIM THU

Người hướng dẫn 2:

PGS.TS BÙI THANH TÙNG

HÀ NỘI – 2019

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


,V
NU

LỜI CẢM ƠN
Với mỗi sinh viên khóa luận là món quà cuối cùng để lại dưới mái trường
thân yêu trước khi rời xa. Và tơi cũng thế, với tơi khóa luận khơng chỉ là món q
mà cịn là hành trang tiếp bước cho tôi trên con đường sắp tới. Mỗi ngày thực

ha
rm
ac
y

nghiệm, mỗi ngày hồn thành khóa luận tơi đã gặp mn vàn khó khăn nhưng thật

may mắn khi tơi nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè và
những người thân yêu để tôi hồn thành món q này một cách tốt nhất.

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn hai thầy cô đã hướng dẫn tơi trong
khóa luận này là ThS. Đặng Kim Thu và PGS.TS Bùi Thanh Tùng – Bộ môn Dược

an
dP

lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược. Các thầy cơ ln quan tâm, tận tình chỉ bảo
những kĩ năng, kiến thức khơng chỉ trong khóa luận này mà cịn định hướng cho tôi
trên con đường tương lai sắp tới, giúp tơi vững tin trên con đường phía trước.
Tơi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã trang bị cho tôi đầy đủ cơ sở vật

ed
ici
ne

chất và cho phép tơi thực hiện khóa luận này. Đồng thời trong q trình thực hiện
tơi xin cảm ơn các thầy cơ giáo phụ trách các bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng,
Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã hết lịng giúp đỡ và tạo điều
kiện cho tơi được sử dụng các dụng cụ, phịng thí nghiệm và cho tôi nhiều bài học

fM

quý giá trong nghiên cứu khoa học.

Cuối cùng, với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đặc

Sc

ho
ol
o

biệt nhất tới bố mẹ, người thân và bạn bè của tôi – những người luôn bên tôi, giúp
đỡ, chia sẻ và đồng hành cùng tơi để vượt qua mọi khó khăn khơng chỉ trong khóa
luận này mà trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và cuộc sống của tôi.

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Hồng Thị Thúy

Co
p

yri
g

ht

@

Tơi xin chân thành cảm ơn!

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


ACh

Độ hấp thụ (Absorbance)
Acetylcholin

ha
rm
ac
y

A

,V
NU

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Acetylcholinesterase

ATCI

Acetylthiocholin iodid

DPPH

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

DTNB

Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic

EtOAc

Ethylacetate

EtOH

Ethanol

FDA

Hiệp hội Quản lý Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ

IC50

Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

ed
ici
ne

n-buthanol

Sc
ho
ol
o

n-BuOH

Đơn vị quốc tế (Interational Unit)

fM

IU

an
dP

AChE

Ph

Chỉ số hoạt động của ion hidro (Hydrogen power)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
Giá trị trung bình

Co
p

yri
g

ht

@

⃐
𝐗

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

,V
NU

Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin ...............................................5
Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE .......................................................5
Hình 1.3. Quả Bơ (Persea americana Mill) .............................................................13

ha
rm
ac
y

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo một số chất trong quả Bơ ............................................17
Hình 2.1. Nguyên liệu chiết xuất ..............................................................................20
Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng tạo màu trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử
Ellman ...............................................................................................................24

an
dP

Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn hạt quả Bơ .....................................................28
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của lá và các phần trong quả Bơ
..........................................................................................................................29

ed
ici
ne

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của acid ascorbic ....................29
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của lá và các phần trong
quả Bơ ...............................................................................................................31
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của Donezepil ...............31

fM

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn hạt quả Bơ 33
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym AChE của các phân đoạn dịch

Sc
ho
ol
o

chiết hạt quả Bơ ................................................................................................34
Hình 3.8. Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ
..........................................................................................................................35

Co
p

yri
g

ht

@

Hình 3.9. Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt quả Bơ để xác định
hằng số ức chế Ki .............................................................................................36

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


DANH MỤC CÁC BẢNG

,V
NU

Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh ................................................................8
Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa..................................9
Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt ba giống Bơ ..............................................................14

ha
rm
ac
y

Bảng 1.4. Thành phần quả Bơ ...................................................................................15
Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng chính của 100g thịt Bơ tươi (USDA) ................16
Bảng 2.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng ...........................................................24
Bảng 3.1. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và acid ascorbic về khả

an
dP

năng quét gốc tự do DPPH ...............................................................................30
Bảng 3.2. Giá trị IC50 của lá Bơ, các phần trong quả Bơ và chất chuẩn Donezepil về
khả năng ức chế enzym AChE .........................................................................32

ed
ici
ne

Bảng 3.3. Giá trị IC50 các phân đoạn từ hạt quả Bơ và acid ascorbic về khả năng
quét gốc tự do DPPH ........................................................................................33
Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các phân đoạn dịch chiết từ hạt quả Bơ và chất chuẩn

Co
p

yri
g

ht

@

Sc
ho
ol
o

fM

Donezepil về khả năng ức chế enzym AChE ...................................................34

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


MỤC LỤC

,V
NU

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ha
rm
ac
y

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer ..........................................................................3

an
dP

1.1.1. Bệnh Alzheimer ................................................................................................3

1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE ...............................................4
1.1.3. Q trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa ..............................6

ed
ici
ne

1.2. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế
enzym AChE in vitro. ................................................................................................9
1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ............................9
1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế

fM

enzym Acetylcholinesterase in vitro .........................................................................11

Sc
ho
ol
o

1.3. Tổng quan về Bơ...............................................................................................13
1.3.1. Nguồn gốc, phân boại .....................................................................................13
1.3.2. Đặc điểm thực vật ...........................................................................................15
1.3.3. Thành phần hóa học ........................................................................................15
1.3.4. Tác dụng và cơng dụng ...................................................................................18

@

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 20

ht

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...............................................................................20

yri
g

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................20

2.1.2. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ...............................................................................20

Co
p

2.1.3. Hóa chất, dung môi .........................................................................................20
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................21

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................21

,V
NU

2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................22
2.3.1. Phương pháp chiết xuất ...................................................................................22
2.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa .............................................22

ha
rm
ac
y

2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE ....................................23
2.3.4. Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE ...................26
2.4. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................................27
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ................................................................................................ 28

an
dP

3.1. Chiết xuất và phân đoạn dịch chiết ................................................................28
3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết lá và các phần trong quả Bơ .............29
3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .............29

ed
ici
ne

3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE ............................................30
3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính cao chiết phân đoạn hạt quả Bơ .......................32
3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .............32

fM

3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE ............................................34
3.3.3. Kết quả xác định động học ức chế enzym AChE ...........................................35

Sc
ho
ol
o

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................................. 37
4.1. Về kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của
dịch chiết lá và quả Bơ ............................................................................................37
4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của
các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất ..........................38

ht

@

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 41

Co
p

yri
g

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


MỞ ĐẦU

,V
NU

Bệnh Alzheimer là một bệnh thối hóa thần kinh tiến triển liên quan đến tuổi,
làm suy yếu khả năng nhớ và nhận thức [34]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới năm
2017, 44 triệu người trên thế giới bị mất trí nhớ và trong đó chiếm tới 60-70% là
bệnh nhân Alzheimer [23]. Bệnh lý học của Alzheimer hiện vẫn chưa được làm

ha
rm
ac
y

sáng tỏ và hiện nay các nhà khoa học cho rằng ở các bệnh nhân Alzheimer có sự kết
hợp của các yếu tố di truyền và môi trường gây ra. Vì thế việc hiểu biết về cơ chế
bệnh vẫn cần được làm sáng rõ và sẽ là chìa khóa để phát triển thuốc điều trị bệnh.
Các nghiên cứu cho thấy sự thiếu hụt trong các chất dẫn truyền thần kinh gây

an
dP

ra suy giảm nhận thức và mất trí nhớ ở bệnh nhân Alzheimer [55].
Acetylcholinesterase (AChE) là một enzym có tác dụng thủy phân chất dẫn truyền
thần kinh acetylcholine. Một số phương pháp điều trị khác nhau có mục tiêu tăng
cường dẫn truyền cholinergic bằng cách tăng lượng tiền chất ACh, ngăn chặn quá

ed
ici
ne

trình thủy phân bởi chất ức chế AChE, kích thích các thụ thể nicotinic và
muscarinic hoặc sử dụng các chất có tác dụng tương tự cholinergic [61]. Bởi vậy,
các chất ức chế enzym AChE đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh
Alzheimer. Mặt khác, sự gia tăng quá mức của các gốc tự do trong cơ thể gây ra

fM

hiện tượng “stress oxy hóa” được cho là một trong những nguyên nhân gây ra các
bệnh mạn tính và thối hóa như bệnh Alzheimer và Parkinson. Tuy nhiên các chất

Sc
ho
ol
o

ức chế enzym AChE như physostigmine, galantamine, tacrine, donepezil,
metrifonate,... lại không mang lại hiệu quả cao và gây ra nhiều tác dụng không
mong muốn như: buồn nôn, nơn, đau bụng tiêu chảy, khó tiêu, phát ban.... [44].
Physostigmin là chất ức chế AChE đầu tiên được dùng cho nghiên cứu điều trị bệnh
Alzheimer, nhưng đã bị thu hồi khỏi thị trường do một số tác dụng không mong
muốn. Tacrine cũng gây độc đối với gan trong các thử nghiệm lâm sàng [62]. Ngồi
ra, các thuốc thuộc nhóm chống oxy hóa như vitamin E, Ginkgo biloba… được sử

@

dụng để điều trị những tổn thương liên quan đến nhận thức ở bệnh nhân Alzheimer

ht

có nguồn gốc từ tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu các dược liệu vừa có hoạt tính

yri
g

chống oxy hóa vừa có khả năng ức chế enzym AChE để phòng và điều trị bệnh
Alzeimer là hướng nghiên cứu thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu trên

Co
p

thế giới.

Bơ có tên khoa học là Persea americana Mill (Lauraceae), là một loại cây

cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ. Nghiên cứu cho thấy trong Bơ
có chứa các hợp chất peptone, b-galactoside, acid glycosylated abscisic, alkaloids,
1

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


cellulose, polygalacto urease, polyuronoids, cytochrome P450,…[48, 64]. Bơ cũng

,V
NU

đã được sử dụng cho điều trị một số bệnh như lở loét, tăng huyết áp, đau bụng,
viêm phế quản [15], tiêu chảy và tiểu đường [22]. Ngồi ra, Bơ có hàm lượng kali
cao và ít natri, giúp điều chỉnh cân bằng điện giải và áp lực máu trong cơ thể, giúp
ổn định huyết áp [32]. Các hợp chất béo omega-3, carotenoid và vitamin làm cho

ha
rm
ac
y

quả Bơ có tác dụng chống viêm [15]. Lá Bơ có tác dụng hạ glucose huyết và hạ
cholesterol tồn phần và LDL, có tác dụng phịng ngừa xơ vữa động mạch [28].
Hơn nữa, lá Bơ cịn có tác dụng trên hệ thần kinh như chống co giật [53], ức chế
enzym AChE và butyrylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa [51].
Tác dụng ngăn ngừa và điều trị bệnh của dược liệu ngày càng thu hút sự chú

an
dP

ý của các nhà nghiên cứu để tìm ra sản phẩm tự nhiên tiềm năng dùng làm thuốc để
chống lại bệnh Alzheimer. Tuy nhiên, qua tìm hiểu thì tại Việt Nam chưa có nghiên
cứu nào về đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa DPPH của lá và quả
Bơ trồng tại Việt Nam để có thể định hướng phát triển thành các sản phẩm hỗ trợ

ed
ici
ne

điều trị bệnh Alzheimer. Vì vậy, chúng tơi đề xuất tiến hành đề tài: “Đánh giá tác
dụng ức chế enzym acetylcholinesterase và tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết
cây Bơ (Persea americana Mill.)” với mục tiêu:
Mục tiêu 1: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của

fM

các bộ phận cây Bơ (Persea americana Mill.).

Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym AChE của

Co
p

yri
g

ht

@

Sc
ho
ol
o

các phân đoạn dịch chiết của bộ phận có tác dụng mạnh nhất.

2

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


,V
NU

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh Alzheimer
1.1.1. Bệnh Alzheimer

Alzheimer là bệnh thần kinh thối hóa tiến triển, làm mất trí nhớ và giảm khả

ha
rm
ac
y

năng nhận thức, là một vấn đề đáng lo ngại, đặc biệt ở những người cao tuổi. Bệnh
đã được mô tả đặc điểm lâm sàng lần đầu tiên tại Đức vào ngày 03 tháng 11 năm
1906 bởi ông Alois Alzheimer. Năm 1910, Kraepelin đã lấy tên ông đặt cho tên
bệnh – bệnh Alzeimer trong tái bản lần thứ 8 bài viết Tâm thần học (Psychiatrie)
của mình [60].

ed
ici
ne

dạng bệnh điển hình là Alzeimer [6].

an
dP

Bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí nhớ ở hầu
hết các quốc gia. Tỷ lệ mắc bệnh Alzeimer tăng dần theo tuổi, 96% là từ 65 tuổi trở
lên. Chi phí cho việc chăm sóc và điều trị ở nước Mỹ ước tính 200 tỷ USD mỗi năm
cho căn bệnh này [26]. Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ với

Các yếu tố nguy cơ mắc bệnh bao gồm cả yếu tố di truyền và yếu tố không di
truyền. Yếu tố di truyền được thấy ở 5% các bệnh nhân mắc bệnh được nghiên cứu
là những đột biến liên quan đến thay thế một nucleotide trong chuỗi ADN (đa hình

fM

nucleotide đơn) (tại nhiễm sắc thể 1, 14 hoặc 21) và các biến thể ε4 (alen) của gen
mã hóa apolipoprotein E (APOE), nằm trên nhiễm sắc thể 19 [43]. Các yếu tố nguy
cơ không di truyền được đưa ra là: tuổi, giới tính. Tuổi là yếu tố nguy cơ quan trọng

Sc
ho
ol
o

nhất đối với bệnh Alzeimer khi các nghiên cứu chỉ ra rằng người trên 60 tuổi sẽ có
tỷ lệ mắc bệnh tăng gấp đơi cứ sau 5-6 năm: ở nhóm tuổi 65-69 số người bị bệnh là
2%; ở nhóm tuổi 80-85 số người bị bệnh là 30-40%. Các nghiên cứu cũng cho thấy
giới tính là một yếu tố nguy cơ quan trọng khi tỷ lệ mắc bệnh của phụ nữ cao hơn
khoảng 1,5 – 2 lần so với nam giới [25].

@

Bệnh Alzheimer có đặc điểm là tiến triển chậm và bắt đầu rất từ từ nên bệnh
nhân thường khó phát hiện bệnh ở giai đoạn khởi phát. Bệnh cảnh lâm sàng là hội

ht

chứng sa sút trí tuệ điển hình và tiến triển theo 3 giai đoạn chính:

Co
p

yri
g

• Giai đoạn 1: Thường kéo dài 2 – 3 năm, được đặc trưng bởi các triệu
chứng: suy giảm trí nhớ, giảm hiệu suất trong giải quyết các cơng việc
thường ngày, rối loạn định hướng khơng gian.
• Giai đoạn 2: Suy giảm trí tuệ diễn ra nhanh chóng, rõ rệt. Nhân cách của
người bệnh cũng bắt đầu có những biến đổi. Thường gặp các triệu chứng:
rối loạn ngôn ngữ, rối loạn tri giác, rối loạn hành vi, thay đổi tính cách.
3

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


,V
NU

• Giai đoạn 3: Giai đoạn cuối cùng. Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối
loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác…)
thường xuất hiện rõ rệt trong bệnh cảnh lâm sàng. Bệnh nhân không thể
giao tiếp và nhận diện khuôn mặt, không thể tự chăm sóc bản thân.
Cho tới thời điểm hiện tại, vẫn chưa có loại thuốc nào có thể chữa khỏi bệnh

ha
rm
ac
y

Alzheimer mà chỉ có thể giúp làm chậm tiến triển của bệnh và làm giảm một số
triệu chứng. Tất cả các bệnh nhân mắc Alzheimer cần được ổn định cân bằng
chuyển hóa và cân bằng thể dịch, đồng thời duy trì trọng lượng cơ thể ở mức bình
thường, điều chỉnh huyết áp, mỡ máu cũng như các vấn đề khác gây khó chịu cho
người bệnh. Ngồi ra cần áp dụng các biện pháp chăm sóc y tế cơ bản tùy theo mức

an
dP

độ nặng nề, suy giảm trí nhớ của người bệnh và các triệu chứng xuất hiện về sau.

ed
ici
ne

Dược liệu có khả năng phòng ngừa và điều trị một số bệnh, trong đó có bệnh
Alzheimer [40]. Có rất nhiều nghiên cứu đã đánh giá hiệu quả của dịch chiết toàn
phần với tác dụng chống lại Alzheimer và tiến hành phân lập các hợp chất có tác
dụng bảo vệ hiệu quả [21]. Các nghiên cứu hóa thực vật chỉ ra nhiều hợp chất có giá
trị bao gồm lignans, flavonoid, tannin, polyphenol, triterpenes, sterol và ankaloid
với một phổ rộng các tác dụng dược lý như kháng viêm, chống amyloidogenic,
kháng cholinesterase, hạ lipid, chống oxy hóa, chống chết rụng tế bào [40].

fM

1.1.2. Enzym AChE và các chất ức chế enzym AChE

Sc
ho

ol
o

Acetylcholin (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe
synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ. ACh tìm thấy ở hành
não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng
vận động). Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp
xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh. Trong các nghiên cứu cho thấy ACh có
liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi
amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc

@

Alzheimer [56].

yri
g

ht

Acetylcholin được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym cholin
acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh,
trong các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử
cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể. ACh sau khi

Co
p

được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE. Đây
là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra cholin và acid acetic.

Cholin sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó,
4

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác

an
dP

ha
rm
ac
y

,V
NU

dụng của ACh [8, 20].

ed
ici
ne

Hình 1.1. Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp Acetylcholin
AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protein có hình elip chứa một rãnh
sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở
đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy
phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính (hình 1.2) là vị trí este hóa, vị trí oxy-

Co
p

yri
g

ht

@

Sc
ho
ol
o

fM

anion, vị trí anion và túi acyl [39].

Hình 1.2. Các vị trí hoạt động của Enzym AChE

5

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của nó

,V

NU

mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc butyrylcholinesterase (enzym
thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH
[36].

ha
rm
ac
y

Theo giả thuyết cholinergic, các chất đối kháng cholinergic gây ra suy giảm
trí nhớ và khả năng nhận thức của con người còn các chất đối kháng muscarinic thì
có tác dụng ngược lại [65]. Do vậy, việc ức chế AChE sẽ duy trì nồng độ và thời
gian hoạt động của ACh tại các khe synap, từ đó có tác dụng duy trì khả năng ghi
nhớ và khả năng học tập của con người [58]. Sự giảm sút nồng độ ACh thường gặp
ở các bệnh nhân Alzheimer, theo nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. và cộng sự,

an
dP

trong não của bệnh nhân Alzheimer có sự thiếu hụt đến gần 90% lượng chất dẫn
truyền thần kinh này [33]. Trong khi nguyên nhân gây bệnh còn chưa được các nhà
khoa học làm rõ thì các chất ức chế AChE là lựa chọn hàng đầu cho các bệnh nhân
Alzheimer, thông qua việc duy trì nồng độ ACh trong não, các chất này có tác dụng

ed
ici
ne

làm giảm các triệu chứng và ngăn chặn sự tiến triển của bệnh [49].
AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất
dẫn truyền ACh. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất
dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với

fM

người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được
đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả

Sc
ho
ol
o

thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải
thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả
thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động của AChE làm tăng nồng độ và thời
gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [31, 56].
1.1.3. Q trình oxy hóa trong cơ thể và các chất chống oxy hóa

@

Q trình oxy hóa trong cơ thể
Oxy hóa là q trình xảy ra phản ứng hóa học, trong đó các electron được

ht

chuyển sang chất oxy hóa hình thành nên gốc tự do. Sự gia tăng các gốc tự do trong

yri
g

cơ thể sinh ra các phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào.
Các gốc tự do là nguyên tử, phân tử hoặc ion với electron chưa ghép cặp rất

Co
p

khơng ổn định và phản ứng hóa học với các phân tử khác. Các dạng hoạt động của
gốc tự do ROS, RNS, RSS [1, 9, 29]. Bản chất của các gốc tự do là có khả năng

6

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


nó tồn tại [13, 29]. Cơ chế hình thành các gốc tự do trong cơ thể:
• Từ chuỗi hơ hấp tế bào trong ty thể.
• Từ q trình peroxyd hóa lipid.
• Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể.

,V
NU

phản ứng cao, thời gian tồn tại ngắn phụ thuộc vào bản chất và điều kiện của hệ mà

ha
rm
ac

y

Đích phân tử chính của các gốc tự do là các protein, ADN (acid
deoxyribonucleic), ARN (acid ribonucleic), đường và lipid. Những phản ứng của
gốc tự do có liên quan đến nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, tim mạch, béo
phì, bệnh Alzheimer, Parkinson, lupus ban đỏ, loét dạ dày,… [29, 37].

an
dP

Các cơ chế chống oxy hóa [42]:

1) Ức chế các enzym xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS.
2) Tác động vào đường truyền tín hiệu oxy hóa khử, thúc đẩy q trình chống
oxy hóa của tế bào.

ed
ici
ne

3) Phản ứng trực tiếp với ROS/ RNS tạo ra các chất ít độc hoặc mất hoạt tính.
Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa chất oxy hóa và chất chống oxy hóa
dẫn đến sự gián đoạn tín hiệu và kiểm sốt oxy hóa khử gây ra nhiều thiệt hại cho

fM

các phân tử sinh học [79]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng stress oxy hóa
đóng một vai trị quan trọng trong sinh lý bệnh Alzheimer [69]. Một số chất chống

Sc

ho
ol
o

oxy hóa như N-acetylcystein, curcumin, resveratrol, vitamin E, acid ferulic, selen,
coenzym Q (CoQ) và melatonin đã được thử nghiệm về khả năng cải thiện hiệu suất
nhận thức ở những người mắc bệnh Alzheimer [70]. Vì vậy những chất có khả năng
cân bằng chất oxy hóa và chất chống oxy hóa sẽ là chất tiềm năng trong q trình
chẩn đốn và điều trị bệnh Alzheimer.
Các chất chống oxy hóa

❖ Các chất chống oxy hóa nội sinh

@

Các chất chống oxy hóa trong cơ thể người được chia thành 2 loại, các chất

ht

chống oxy hóa có bản chất là enzym và các chất chống oxy hóa khơng phải enzym.

yri
g

Các chất chống oxy hóa có bản chất là enzym quan trọng ngăn chặn sự hình

thành hoặc trung hòa các gốc tự do trong cơ thể là: glutathion peroxidase, catalase,

Co
p

superoxid dismutase, Glucose-6 phosphat dehydrogenase. Các chất chống oxy hóa
khơng phải enzym cũng được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu từ thức ăn

bổ sung [29].

7

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Các enzym

,V
NU

Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh
Các chất không phải enzym
Co – Enzym: Q10

Catalase

Vitamin A

Superoxide dismutase

Hợp chất chứa nito (non –protein): uric

Glucose – 6 phosphat dehydrogenase

Hợp chất chứa S: Glutathion

ha
rm
ac
y

Glutathion peroxidase

Mỗi chất chống oxy hóa có cơ chế tác dụng riêng với từng loại gốc tự do và
có thể hiệp đồng với nhau để loại trừ gốc tự do. Nhờ các chất chống oxy hóa này

an
dP

mà quá trình oxy hóa chỉ xảy ra ở mức độ sinh lý nhất định, khi đó các dạng oxy
hóa hoạt động thực hiện được chức năng sinh lý và duy trì được cân bằng trao đổi
chất. Việc tìm kiếm các hợp chất chống oxy hóa mới có thể tạo ra sự kết hợp hiệu

ed
ici
ne

quả trong điều trị một số bệnh có liên quan đến q trình oxy hóa trong cơ thể.
❖ Chất chống oxy hóa trong hóa dược

Thuốc chống viêm: Theo nghiên cứu, nhóm thuốc này được xếp thành 3 nhóm:

Sc
ho

ol
o

fM

• Nhóm 1: Những chất làm giảm gốc O2●, ●OH, H2O2 như aspirin,
indomethacin, ibubrofen…
• Nhóm 2: Những chất làm giảm ●OH nhưng làm giảm mạnh O2●, H2O2 như
hydrocortisol, 2 -3 hydroxybenzoic…
• Nhóm 3: Thuốc làm giảm ●OH ở nồng độ rất thấp như phenylbutanol.
Các chất chống oxy hóa tổng hợp
BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), PG
(propyl gallate), OG (octyl gallate), TBHQ (tert – butylhydroquinon)…

@

❖ Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc thực vật
Trong thế giới thực vật có rất nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa thuộc
Vitamin E: Ức chế phản ứng oxy hóa lipid, bảo vệ tế bào và các phần tử
chức năng khỏi sự oxy hóa quá mức nhờ đó có tác dụng chống lão hóa, kéo
dài tuổi thọ.
Vitamin C: Là chất cho điện tử, có khả năng loại bỏ những gốc tự do ở pha
nước của tế bào, có khả năng tái tạo Vitamin E dạng oxy hóa về dạng khử
[30].

Co
p

yri
g

-

ht

nhiều nhóm khác nhau. Đáng chú ý nhất là các vitamin và dẫn xuất của phenol:

-

8

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Flavonoid: Là một nhóm các phenolic thực vật có tác dụng chống oxy hóa và
tạo phức chelat rất đáng chú ý. Chúng tập trung nhiều nhất trong trái cây, rau
quả, rượu, trà và cacao. Flavonoid tồn tại trong thực phẩm dưới dạng
glycoside và polymer, được thối hóa ở nhiều mức độ trong đường tiêu hóa.
Xu hướng ức chế q trình trung gian tạo gốc tự do của một số flavonoid bị
chi phối bởi cấu trúc hóa học của nó (cấu trúc nhân flavan, số lượng và vị trí
các nhóm thế). Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao EGCG từ
chè xanh, Genistein trong đậu nành, quercetin, resveratrol [38].
Xanthan: Là một hợp chất phenol thực vật có hoạt tính chống oxy hóa, có
mặt trong một số thực vật nhiệt đới.

-

ha
rm
ac

y

,V
NU

-

Ngồi ra cịn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên cũng

an
dP

có tác dụng chống oxy hóa như carotenoid, acid phenolic, lignin, …

Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa và tác dụng ức chế
enzym AChE in vitro.
1.2.1. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro
1.2.

ed
ici
ne

Đánh giá khả năng chống oxy hóa có rất nhiều phương pháp được chia thành
2 loại: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo [18]:
Bảng 1.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa

1. Dọn gốc tự do DPPH
3.
4.

5.
6.

Sc
ho
ol
o

2. Dọn gốc tự do HO

fM

Các phương pháp in vitro

Dọn gốc tự do nitric oxid
Dọn gốc tự do peroxynitrite
Phương pháp định lượng ABTS
Phương pháp TRAP

Các phương pháp in vivo

1. Khả năng làm giảm sắt trong
huyết tương.
2.
3.
4.
5.

Khả năng làm giảm glutathion
Glutathion peroxidase

Glutathion – S – Tranferase
Superoxid dismutase

6. Catalase

8. Dọn gốc tự do superoxid (SOD)

7. γ– glutanyl transpeptidase

9. Dọn gốc tự do hydroxyl
10. Phương pháp HORAC

8. Glutathion reductase
9. Peroxid hóa lipid

11. Phương pháp ORAC
12. Phương pháp RP

10. Thử nghiệm LDL

yri
g

ht

@

7. Phương pháp FRAP

Co

p

13. Phương pháp DMPD

14. Enzym xanthin oxidase
15. Phương pháp CUPRAC…

9

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Thử tác dụng dọn gốc tự do DPPH

,V
NU

Một số thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro

Ngun tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với chất
chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và khơng hấp thụ ánh
sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung

ha
rm
ac
y

dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH cịn lại sau phản ứng.

Ưu điểm: Nhanh, cho kết quả khá chính xác, dễ thực hiện và không tốn kém.
Tuy nhiên, DPPH không tồn tại trong cơ thể sống nên phép thử này chỉ mang ý
nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử. Dùng trong sàng lọc
Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2●

an
dP

các mẫu dược liệu [13, 17, 29, 47].

Nguyên tắc: Gốc tự do O2● được hình thành trong q trình oxy hóa xanthin

ed
ici
ne

thành acid uric được xúc tác bởi enzym xanthinoxidase. Gốc O2● tạo thành phản
ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp thụ bước sóng tại
560 nm, đo hấp thụ quang của dung dịch phản ứng tại bước sóng này sẽ biết lượng
O2● tham gia phản ứng [13, 18, 29, 50]
đối ổn định và chính xác.

fM

Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, u cầu ít máy móc, kết quả thu được tương

Sc
ho
ol
o

Thử tác dụng dọn gốc tự do hydroxyl ●OH
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng đường 2 – deoxyribose của gốc
●

OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là

MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid thiobarbituric (TBA)
ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng có hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 532 nm. Đo

@

hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng này sẽ cho biết nồng độ MDA được tạo
ra sau quá trình oxy hóa. Từ đó tính được mức độ deoxyribose bị oxy hóa và mức
độ dọn gốc tự do ●OH của mẫu thử.

yri
g

ht

Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc ●OH có hoạt tính
rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quả ít chính xác hơn các

Co
p

thử nghiệm trên [13, 18, 29, 47].

10

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


,V
NU

1.2.2. Các phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế
enzym Acetylcholinesterase in vitro
Quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới cần phải trải qua rất nhiều giai
đoạn và một trong những giai đoạn đầu của q trình là nghiên cứu sàng lọc. Có
nhiều phương pháp được sử dụng trong giai đoạn này và phương pháp thử in vitro

ha
rm
ac
y

được áp dụng khi nó đáp ứng được một số tiêu chí như: có thể tiến hành trên nhiều
mẫu, lượng mẫu thử ít, kết quả nhanh, chi phí thấp. Các nhà khoa học trong và
ngồi nước đã tiến hành nhiều phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính của
enzym AChE, bao gồm: phương pháp đo quang, phương pháp điện di, phương pháp
huỳnh quang với cơ chất phát huỳnh quang, phương pháp sử dụng thang pH hay xác
định hoạt độ điện hóa của enzym AChE. Đối với nghiên cứu tác dụng ức chế enzym

an
dP

AChE in vitro, có 2 phương pháp thường được sử dụng là phương pháp sử dụng
thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B.

Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

1.2.2.1.

ed
ici
ne

Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm
nhất trong số những phương pháp được sử dụng đánh giá tác dụng ức chế AChE in
vitro. Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên
cứu cùng hướng, trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương

fM

pháp sắc ký lớp mỏng sinh học. Phương pháp này sử dụng cơ chất là

Sc
ho
ol
o

acetylthiocholin iodid (ATCI) và thuốc thử là 5,5’ - dithiobis - nitrobenzoic acid
(DTNB).
❖ Phương pháp đo quang

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzym AChE dựa
vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 [45]. Nguyên tắc
của phương pháp: cơ chất ATCI bị thủy phân nhờ xúc tác của cholinesterase tạo

@

thiocholin. Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio2-nitrobenzoic acid màu vàng. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ

ht

của dung dịch ở bước sóng 412 nm.

yri
g

Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức chế AChE in vitro khác
tiếp tục được thực hiện. Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi

Co
p

Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số
thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch

cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng
[57, 59].
11

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng

,V

NU

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp
sắc ký lớp mỏng sinh học đã được phát triển. Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng
được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được

ha
rm
ac
y

phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzym. Những chất gây ức chế
AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng [16].
Một trong những hạn chế của phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học là có
thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản
mỏng không phải do tác dụng ức chế enzym AChE. Để khắc phục hạn chế này, bên

an
dP

cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối
chiếu). Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở
giai đoạn phun thuốc thử hiện màu. Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử
DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch enzym
AChE. Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn

ed
ici
ne

hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch enzym AChE được phun sau. Cách
bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai
bản là những vết cho phản ứng dương tính giả [14].
Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

1.2.2.2.

fM

So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng

Sc
ho
ol
o

phương pháp này để đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro khá hạn chế. Phương
pháp này sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetat và thuốc thử là muối Fast Blue B
(muối O-dianisidin bis(diazotized) zinc double).
❖ Phương pháp đo quang

Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần
đầu tiên bởi tác giả Van Asperen K. vào năm 1962 [63]. Nguyên tắc của phương

@

pháp: cơ chất α-naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất α-

ht

naphthol. Chất này sau đó phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản
phẩm màu diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung

yri
g

dịch ở bước sóng 600 nm. Tuy nhiên, sau đó khơng có nhiều nghiên cứu sử dụng
phương pháp này để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro và một

Co
p

trong số đó là nghiên cứu của tác giả Di Giovanni S. [33, 46]. Phương pháp được sử
dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của

12

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


tác giả Van Asperen về: nguồn gốc và hoạt độ của enzym, hóa chất để bất hoạt

,V
NU

enzym và nồng độ dung dịch cơ chất.
❖ Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương pháp
sắc ký lớp mỏng sinh học để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in

ha
rm
ac
y

vitro và được phát triển bởi Marston năm 2002. Ở phương pháp này, sau khi bản
mỏng được triển khai, dung dịch enzym được phun lên bản mỏng. Sau đó, hỗn hợp
gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetat và dung dịch thuốc thử muối Fast Blue B
được phun lên bản mỏng. Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết

an
dP

màu trắng trên nền màu tím sẫm [33]. Cũng giống phương pháp sắc ký lớp mỏng
sinh học sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học sử dụng
thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả. Để loại

ed
ici
ne

trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử
được triển khai. Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phun
lên bản mỏng mà khơng có dung dịch enzym. Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết
đó là vết dương tính giả.

fM

Bên cạnh đó, để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro trong

nghiên cứu, tác giả Tang Z. M. và cộng sự đã sử dụng phương pháp điện di mao
quản [41]. Tuy nhiên, phương pháp này địi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp, thao
tác thử nghiệm tương đối phức tạp, hạn chế về số lượng mẫu thử nên hiện nay mới

Sc
ho
ol
o

chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố và ít được sử dụng
trong nghiên cứu sàng lọc.
1.3. Tổng quan về Bơ
1.3.1. Nguồn gốc, phân boại

Tên khoa học: Persea americana mill hay Persea gratissima gaern.

@

Tên tiếng Anh: Avocado

ht

Giới: Plantae

Co
p

yri
g

Bộ: Laurales
Họ: Lauraceae
Chi: Persea
Lồi: P.american
Hình 1.3. Quả Bơ (Persea americana Mill)
13

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Đa số các giống Bơ hiện nay đều có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới Trung

,V
NU

Mỹ như Mexico, Guatemala và quần đảo Antilles vì các khảo cứu phát hiện rằng
những cây Bơ mọc hoang dại tại những xứ này [68]. Hóa thạch hạt Bơ có niên đại
7000 năm Trước cơng ngun đã được tìm thấy tại một khu khảo cổ ở Mexico. Tên
“Avocado” bắt nguồn từ tiếng Aztee là ahuacucuahitl, trong tiếng Tây Ban Nha rút

ha
rm
ac
y

ngắn đi gọi là Aguacate và trong tiếng Anh gọi là Avocado hay còn gọi là trái trạng
sư [12].
Cây Bơ được xếp vào loại thực vật có hoa, hai lá mầm và gồm rất nhiều
giống thuộc họ Long não (Lauraceae) [2, 3]. Phần lớn các giống trồng thương mại
đều thuộc vào giống Mexico, giống Guatemala và giống Antilles (Tây Ấn). Giống

an
dP

Guatemala và Antilles (Tây Ấn) được xếp vào loài P.americana Mill, giống Mexico
được xếp vào lồi P.drymyfolia với các đặc tính quan trọng như sau [12]:
Bảng 1.3. Đặc điểm phân biệt ba giống Bơ

Giống

Mùi lá

Vỏ trái

ed
ici
ne

Dầu

trong

Hạt

cơm

Hôi mùi Mỏng
anique

khoảng

To

fM

Mexico

Cao

Khoảng rỗng
hạt

Ưu điểm

Lỏng, không Chịu rét tốt,
chất lượng tốt

sát thịt trái

Sc
ho
ol
o

0,8 mm
Không
Guatemala hôi

Dày
từ Trung Nhỏ

1,5 – 1,8 bình

Dính chặt vào Chịu rét khá
cơm
tốt

mm

Khơng

Trung

hơi

bình

Thấp

To

Lỏng,

khi Chịu

chín lắc kêu

nóng,

chịu mặn tốt

@

Antilles

ht

Ở Việt Nam, cây Bơ được trồng lần đầu tiên ở tỉnh Lâm Đồng do người Pháp

yri
g

đưa vào từ những năm 1940 [12]. Những vùng trồng Bơ chủ yếu ở nước ta là những
vùng cao thuộc các tỉnh như Đồng Nai, Bà Rịa Vũng Tàu, Lâm Đồng, Đắk Nông và
Đắk Lắk với tổng diện tích 40.000 ha đang thu hoạch [5]. Người kinh doanh thường

Co
p

phân chia trái Bơ thành 3 loại dựa theo hàm lượng và màu sắc của thịt quả [12]:
• Bơ sáp: Thịt quả màu vàng sẫm và có hàm lượng dầu cao nhất.
• Bơ mỡ: Thịt quả màu vàng và có hàm lượng dầu trung bình.
14

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


• Bơ nước: Thịt quả màu hơi vàng và có hàm lượng dầu thấp nhất.

,V
NU

1.3.2. Đặc điểm thực vật

Cây Bơ cao khoảng 20 mét. Lá lúc cịn non thường có lông mịn, màu hơi đỏ
hoặc màu đồng nhưng đến khi trưởng thành, lá có màu xanh láng và dài [12]. Hình

ha
rm
ac
y

dạng lá rất thay đổi từ hình thuỗn đến hình dao, mỗi lá dài 12 – 25 cm [5]. Chóp lá
thường bén nhọn nhưng có vài giống chóp lá hơi trịn.
Hoa có màu xanh nhạt hoặc xanh vàng, thường mọc thành chùm trên đoạn
cuối cành tạo quả. Mỗi hoa lớn độ 5 - 10 mm, khi hoa nở hoa có đường kính 12 - 14
mm. Quả Bơ có trọng lượng và hình dáng khác nhau tùy giống: trịn, trứng, quả lê,

an
dP

thuỗn, …

Quả có ba phần rõ rệt: vỏ, thịt và hạt. Bề dày và cấu tạo vỏ thay đổi tùy
giống. Quả của những giống thuộc chủng Mexico thường có vỏ mỏng và láng,
chủng Guatemala và Antilles thường có vỏ dày hơn [12]. Màu sắc của vỏ quả thay

ed
ici
ne

đổi từ màu xanh sáng, màu xanh nhạt, xanh vàng hoặc tím đến tím sẫm khi chín.
Thịt quả thường có màu vàng kem hoặc màu vàng sáng, có giống cho thịt màu vàng
xanh ở sát phần vỏ quả. Thịt quả có hàm lượng dầu béo rất cao so vớ các loại quả

fM

khác. Hạt trái Bơ hình tựa quả trứng, dài 5 – 6 cm, nằm trong trung tâm, màu nâu
đậm và rất cứng. Hạt được 2 lớp vỏ lụa bao bọc, gồm có hai tử diệp (nội nhũ) hình
bán cầu. Giữa hai tử diệp có phơi hạt nằm về phía cuống trái và khi hạt nảy mầm,
cây mầm sẽ mọc thẳng từ dưới lên trên theo trục thẳng đứng của hạt [5]. Mặt ngoài

Sc
ho
ol
o

tử diệp trơn láng hoặc sần sùi tùy theo giống và hình dạng cũng thay đổi khá nhiều.
1.3.3. Thành phần hóa học

Khối lượng của quả Bơ cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ các thành phần. Khi quả
càng to, phần thịt càng nhiều, các phần hạt và vỏ càng ít. Thành phần thường có tỷ

Co
p

yri
g

ht

@

lệ như sau [12]:

Bảng 1.4. Thành phần quả Bơ
Bộ phận

Tỷ lệ

Thịt Bơ

34,7 ± 38 %

Vỏ Bơ

23,6 ± 27 %

Hạt Bơ

37,5 ± 40,6 %

15

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


Phần thịt Bơ thường chiếm 1/3 trọng lượng quả Bơ và đây cũng là phần có

,V
NU

nhiều thành phần dinh dưỡng nhất được tìm thấy. Thịt Bơ chứa hàm lượng protein,
carbohydrat và lipid tương đối cao so với các loại trái cây khác và thay đổi tùy theo
vùng sinh thái, giống Bơ, độ chín cũng như thời gian thu hái. Trong thịt Bơ cịn
chứa khoảng 14 loại vitamin và nhiều khống chất cần thiết cho cơ thể [5].

Thành phần
Calories

Protein

ed
ici
ne
fM

Kali

340 – 723
20 – 80
10 – 15

mg

40 – 60
0,5 – 2

iu

Vitamin B2

95 – 230

µg

60 – 240

µg

Cholin

17 – 22

mg

Folacin

30 – 62

µg

Vitamin C

1,6 – 30

iu

@

370 – 750

ht

β-caroten

Sc
ho
ol
o

Phospho

g

1,5

Chất khoáng

Vitamin

Kcal

6,0

Xơ (dietary fiber)

Sắt

171,0

17,0

Carbohydrat tổng

Magie

Đơn vị

2,2

Chất béo

Canxi

Hàm lượng

an
dP

Thành phần dinh dưỡng chính

ha
rm
ac
y

Bảng 1.5. Thành phần dinh dưỡng chính của 100g thịt Bơ tươi (USDA)

Co
p

yri
g

Vitamin B1

16

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma


1,6 – 2,4

iu

,V
NU

Vitamin E
Phytochemical

75

Lutein

293

mg

mcg

ha
rm
ac
y

β-sitosterol

fM

ed
ici
ne

an
dP

Một số hợp chất phenol và alkanoid cũng được tìm ra trong thịt Bơ [5] như:

Sc
ho
ol
o

Hình 1.4. Công thức cấu tạo một số chất trong quả Bơ

Nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy trong Bơ có chứa các hợp chất
peptone, b-galactoside, acid glycosylated abscisic, alkaloids, cellulose, polygalacto
urease, polyuronoids, cytochrome P450 và các tinh dầu [48, 64].
Hạt Bơ chưa được nghiên cứu đầy đủ các chất nhưng cũng phát hiện ra các

@

chất chính có trong một số dịch chiết hạt Bơ [7] bao gồm: 1,3-Dicyclopentyl-2-ndodecylcyclopentane và Squalene (trong dịch chiết methanol); E-11-Methyl-12-

yri
g

ht

tetradecen-1-ol acetat và Z,Z 4,15-Octadecandien-1-ol acetat (dịch chiết etyl
acetate); E-11-Methyl-12-tetradecen-1-ol- acetat và Stigmast-5-en-3-ol (dịch chiết

Co
p

hexan). Trong đó Squalene và Stigmast-5-en-3-ol là hai chất có nhiều ứng dụng
trong y học và thực phẩm.

17

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma