Bài ôn thi Phân tích vi sinh thực phẩm HUFI

ÔN TẬP
CHƯƠNG 3:
- Thành phần môi trường:
1. Nước.
2. Thạch.
3. Peptone.
4. Cao thịt.
5. Cao nấm men.
6. Một số tác nhân tạo mơi trường kị khí.
7. Các chế phẩm từ mật bị.
8. Các chất ức chế chon lọc.
9. Các cơ chất để thử phản ứng sinh hóa.
10. Các chất chỉ thị màu.
- Yêu cầu cơ bản:






Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết.
Có độ pH thích hợp.
Có độ nhớt nhất định.
Khơng chứa các yếu tố độc hại.
Tuyệt đối vô trùng.

- Các bước chuẩn bị môi trường dinh dưỡng:
1.
2.
3.
4.

5.
6.
7.

Pha chế.
Làm trong môi trường.
Điều chỉnh pH
Phân phối môi trường vào dụng cụ.
Khử trùng môi trường
Làm thạch nghiêng, thạch đứng và đổ vào đĩa petri
Bảo quản và kiểm tra môi trường.

- PP khử trùng môi trường:





PP Pasteur.
PP Tyndal.
PP lọc bằng dụng cụ lọc vi khuẩn.
PP hấp bằng hơi nước bao hòa ở áp suất cao.


CHƯƠNG 4:
ST
T

1

Loại PỨ

Lên men

Nguyên tắc

Nhằm xác định khả
năng của một số vi
sinh vật lên men
(phân giải) một
carbohydrate đặc
hiệu có trong môi
trường cơ bản tạo
acid (hoặc acid và
hơi).

Màu phản ứng, KQ

Cơ chế

Mơi trường: mơi trường
phenol red base

1 số vsv có khả năng
lên men các loại
CHO đặc hiệu tạo ra
acid làm giảm pH
dẫn đến thay đổi màu
chỉ thị phenol red
trong môi trường

acid có màu vàng

- Sinh aicd
(+): đỏ sang vàng
(-): đỏ.
- Sinh hơi
(+): Khi có bọt khí trong
ống
(-): Ko có
Cần phải thực hiện lại thử
nghiệm với ống nghi ngờ.

Đồng thời CO2
được tạo thành trong
q trình lên men sẽ
được giữ lại tạo bọt
khí làm nổi ống
Dulham(mt lỏng), vỡ
thạch (mt rắn)

Môi trường: môi trường
Hugh-Leifson.

2

3

4

OXH – Lên

men

Bile Esculin

Citrate

Xác định khả năng
của vi sinh vật sử
dụng nguồn
carbonhydrate làm
nguồn năng lượng
thông qua phương
thức lên men hoặc
hô hấp.

Thử nghiệm này
phân biệt vi sinh vật
dựa trên khả năng
thủy phân liên kết
glucoside trong
esculi thành
esculetin và glucose
khi có sự hiện diện
của muối mật.
Nhằm xác định khả
năng của một vi
sinh vật sử dụng
citrate như nguồn
carbon duy nhất cho
hoạt động trao đổi

chất và làm kiềm

(+): Bị acid hóa cả trên
mặt và phần sâu.
(-): Kỵ khí: bị acid hóa
khắp thạch sâu.
Hiếu khí: ko bị trên bề
mặt, chỉ bị phần đáy.
 vi sinh vật biến dưỡng
carbohydrate theo
phương thức oxi hóa.
Mơi trường: mơi trường
Aesculin hay Edwards
(+): Môi trường chuyển
thành đen hay nâu đen.
(-): Môi trường không đổi
màu.
Môi trường: môi trường
Simmon citrate
(+): Môi trường chuyển từ
xanh lục sang xanh
dương (mt kiềm)
(-): xanh lục (màu ban

Esculetin+muối sắt 
tạo thành phức hợp
màu đen hay màu
nâu đen.

Sự thay đổi pH của

môi trường được
nhận biết nhờ chỉ thị
màu Bromothymol
blue.


Vsv sử dụng citrate
trong mt có natri
nitrate àion Na+
hóa mơi trường

đầu)

Hoặc sd muối
amonium vơ cơà
NH3
Làm tăng pH từ đó
đổi màu chỉ thị
bromothymol blue

5

6

Malonate

Catalase

Nhằm xác định khả
năng của một vi

sinh vật sử dụng
malonate như nguồn
carbon duy nhất cho
hoạt động trao đổi
chất và làm kiềm
hóa mơi trường

Nhằm xác định sự
có mặt của enzyme
catalase

Môi trường: môi trường
lỏng malonate
(+):Môi trường chuyển từ
xanh lục sang xanh
dương
(-): Xanh lục
Mơi trường: dd H2O2
30%
(+): Sủi bọt khí xung
quanh sinh khối

Thủy phân đc
Malonate  có khả
năng sử dụng muối
amonium NH3
kiềm hóa mt  tăng
pH  đổi màu chỉ thị
bromthymol blue

Catalase cắt H2O2 
H2O2 + O2 (bọt
khí)

(-): Khơng sủi bọt

7

8

9

Đánh giá hoạt tính
enzyme của vi sinh
Decarboxyla
vật khử nhóm
se
carboxyl của acid
amin sinh một amin
tạo tính kiềm
Kiểm tra khả năng
của một vi sinh vật
làm đông huyết
Coagulase tương thỏ hoặc
người do tác dụng
của enzyme
coagulase
Xác định khả năng
của vi sinh vật phân
giải urea tạo hai

phân tử ammonia do
Urease
tác dụng của
enzyme urease làm
kiềm hóa mơi
trường.

Mơi trường: mơi trường
decarboxylase basal chứa
chỉ thị bromocresol tím
(+): Đục, tím
(-): Trong, vàng

Vsv có khả năng khử
carboxyl của â tạo
amin có tính kiềm
sinh CO2  Tăng pH
 đổi màu chỉ thị

(-): Lỏng (sau 24h)

Vsv đặc biệt là
Staphylococcus có
enzyme coagulase
làm kết tụ các thành
phần của huyết tương
tạo khối đông làm
đông tụ huyết tương

Môi trường urea

lỏng(rắn), chứa chỉ thị
phenol đỏ
(+): Vàng  Đỏ cánh sen
(-): Vàng

Urea bị phân giải bởi
enzyme urease thành
2 phân tử ammonia
làm kiềm hóa mt đổi
màu chỉ thị

Mơi trường: huyết tương
thỏ hay người đông khô
dạng thương phẩm
(+): Huyết tương đông
(sau 4h, 8h, 12h, 24h)


10

11

Gelatinase

Sinh H2S

Xác định khả năng
phân giải gelatin
của vi sinh vật
Một số vi sinh vật

tổng hợp được
enzyme
desulfohydrase xúc
tác sự chuyển hóa
trong điều kiện kỵ
khí các acid amin
chứa lưu huỳnh như
cysteine, cystin,
methione và phóng
thích H2S.

Xác định khả năng
sinh indol từ
tryptophan
12

13

Indol

KIA / TSI
(có chứa cả
glu và lac;
chỉ thị
phenol red
và có thành
phần muối
sắt)

(Kiểm tra xem vsv

có enzyme
tryptophanase hay
ko).

Xác định khả năng
sử dụng các nguồn
carbon khác nhau
(glucose, lactose) và
khả năng sinh H2S
của vi sinh vật.
vi sinh vật sẽ sử
dụng Glucose để lên
men nên khiến toàn
bộ môi trường trở
nên axit (màu vàng)
trong khoảng 8-12
giờ. Phần gốc vẫn
giữ trạng thái axit
thậm chí sau khi ủ
khoảng 18-24 giờ
bởi vì sự có mặt axit
hữu cơ từ việc lên
men glucose dưới

Mơi trường: mơi trường
canh NB bổ sung 10%
gelatin
(+): Hóa lỏng
(-): Đơng đặc

Mơi trường: các loại mơi
trường có thể được sử
dụng cho thử nghiệm sinh
H2S là KIA, TSI, BSA
(+): Đen
(-): Không chuyển màu

Môi trường và thuốc thử:
môi trường Trypton water,
thuốc thử Kowac’s (thuốc
thử chứa pDimethylaminobenzaldeh
yde (p-DMABA))
(+):Bề mặt mơi trường
xuất hiện vịng đỏ cánh
sen
(-): Màu vàng chanh
Môi trường: môi trường
KIA hoặc TSI
Đáy ống nghiệm
Glucose (+): Màu vàng
(lên men glucose)
Glucose (-): Màu
đỏ/không đổi màu (không
lên men glucose) màu ban
đầu của chỉ thị
- Màu đen: sinh H S
2
- Vỡ thạch: sinh hơi từ
glucose
Mặt nghiêng:

Lactose và/hoặc Sucrose
(+): Màu vàng (lactose

Thủy phân Gelatin
bởi enzyme
gelatinase
polypeptid +aa Mất
tính đơng  Hóa lỏng
Vsv có enzyme
desulfohydrase trong
điều kiện kị khí
chuyển protein thành
aa chứa lưu huỳnh và
phóng thích H2S.
H2S tạo tủa màu đen
vs chỉ thị sulfide

Tryptophan bị oxh
bởi tryptiphanase
thành sp chứa indol
Phyrol của indol
chứa nhóm CH2
+nhân benzen của
p_DMABA phức
chất dạng quinone có
màu đỏ
Lên men glucose tạo
acid giảm pH chỉ thị
phenol red màu vàng
H2S sinh ra tạo tủa

màu đen vs chỉ thị
sulfide
Sinh hơi do tạo CO2
Nếu sinh vật lên men
glucose nhưng
lại không lên men
lactose và/hoặc
sucrose, sau đó mặt
nghiêng sẽ trở thành
màu đỏ và phần gốc
vẫn màu vàng (K/A)
trong khoảng 18
đến 24 giờ.


điều kiện kỵ khí
trong phần đáy ống.
Mặt nghiêng của
mơi trường trở về
trạng thái kiềm,
được chỉ thị bằng
màu đỏ vì các sản
phẩm lên men
bị oxy hóa thành
CO2 và H2O và
peptone trong điều
kiện hiếu khí, phần
mặt nghiêng trải qua
oxy hóa giải phóng
các amine kiềm

14

Nitratase

Xác định khả năng
sử dụng nitrat (khử
NO3-) của vi sinh
vật

và/hoặc sucrose được sử
dụng)
Lactose và Sucrose (-):
Màu đỏ/không đổi màu
(lactose và sucrose không
được sử dụng).

Môi trường và thuốc thử:
môi trường nitrat và
thuốc thử Gress A (acid
sulfanilic) và Gress B (αnaphthylamin).
(+): có màu hồng đỏ
Nếu ko có màu: tt thêm
bột Zn
(+): Ko chuyển màu
(-): Màu hồng đỏ

Nếu bên cạnh việc
lên men glucose sinh
vật còn lên men

lactose và/ hoặc
sucrose, sản phẩm
lên men được hình
thành trên mặt
nghiêng sẽ trung hịa
hơn amine kiềm
chuyển mặt nghiêng
thành axit (màu
vàng) (A/A), hiện
tượng này sẽ xuất
hiện sau khoảng 18
tới 24 giờ.
Nếu sinh vật khơng
phải dạng lên men,
thay vì sử dụng
đường, nó sẽ sử dụng
pepton như một
nguồn năng lượng
thay thế dưới điều
kiện hiếu khí trên
mặt nghiêng, việc
này khiến trở nên
kiềm được chỉ thị bởi
mà đỏ trong khi
khơng có sự thay đổi
màu sắc của gốc
Lần 1: định tính
nitrite
Có enzyme
nitratreductase khử

NO3- thành NO2phản ứng vs 2 loại
thuốc thử tạo hc màu
đỏ
Lần 2: định tính
nitrate (bổ sung ít
Zn)
Nếu khống màu hoặc
k có kn khử NO3hoặ xảy ra nhưng
NO2- bị khử thành
N2


Nếu đỏ có nghĩa là
cịn NO3- tác dụng
vs Zn tạo NO2- sau
đó pứ vs nitrate tạo
màu đỏà khơng có
sự khử NO3Khơng đổi màu
nghĩa là hết NO3trong mtà có sự khử
NO3-

15

Oxidase

Xác định sự hiện
diện của hệ enzyme
oxidase (A) ở vi
sinh vật

Thuốc thử: Giấy tẩm Ndimethyl-para
phenylenediamine hoặc
dung dịch 1% tetramethyl- A + B  indolphenol
p-phenylenediamine. (màu (màu xanh dương)
hồng)(B)
(+): Xanh dương đậm
(-): Hồng

16

17

18

ONPG

MR
(Methyl
Red)

VP
(Voges Proskauer)

Xác định sự hiện
diện của enzyme βgalactosidase (A) ở
vi sinh vật

Môi trường: môi trường
lỏng ONPG (B)

Kiểm tra khả năng
của vi sinh vật lên
men glucose tạo các
sản phẩm cuối mang
tính acid

Môi trường và thuốc thử:
môi trường lỏng MR-VP,
thuốc thử methyl red

Xác định khả năng
của một số vi sinh
vật tạo sản phẩm
cuối mang tính
trung tính là acetoin
(acetylmethylcarbin
ol-AMC) do lên
men glucose.

(+): Vàng
(-): ko đổi

(+): Đỏ
(-): Đỏ  Vàng

A+ B 
o-nitrophenyl (có
màu vàng)
Có khả năng lên men
lactose

Lên men glu thành
acid pyruvic sau đó
chuyển hóa thành
ethanol, acid acetic,
acid lactic,… giảm
pH (4~4,5) nên MR
có màu đỏ
pH cao hơn (mt
kiềm) có màu vàng

Vsv chuyển hóa glu
thành acid pyruvic 
Môi trường và thuốc thử:
acetoin (AMC) trong
MR (chỉ thị) - VP
mt kiềm  diacetyl
(+): Đỏ cam pH acid????
kết hợp vs -naphtol
(-): Vàng or Nâu đất
tạo hợp chất màu đỏ
cam


19

CAMP

- Nhằm xác định
khả năng của vi sinh
vật tạo ra nhân tố

CAMP có khả năng
phối hợp với βhemolysin (yếu tố
tan huyết) của
Staphylococcus tác
động lên hồng cầu
bò hoặc cừu sinh ra
hiện tượng tan huyết
tại vùng tiếp giáp
của hai vi sinh vật.
- Nhằm xác định
cũng hiện tượng tan
huyết do phối hợp
như trên giữa nhân
tố CAMP và αhemolysin của
Clostridium
perfringens.

20

Tính di động

Xác định khả năng
di động của vi sinh
vật

Môi trường: môi trường
thạch máu
Cơ chất β-lysine: Dùng S.
aureus hoặc bất kỳ chủng
nào tạo nhiều β-lysine

Vi sinh vật chứng:
Streptococcus spp. đã định
danh
(+): Có vùng tan huyết
hình mũi tên
(-): ko có
Đối với nhóm đối chứng
+ Streptococcus
agalactiae
- Streptococcus faecalis
Môi trường: môi trường
bán lỏng NA, để đứng.
(+): Lan ra khỏi đường
cấy
(-): Chỉ mọc theo đường
cấy

So sánh các phương pháp Elisa
Tiêu chí
Khái niệm

Các bước thực
hiện

Trực tiếp
Xét nghiệm ELISA
trực tiếp chỉ sử dụng
kháng thể chính để
phát hiện kháng
nguyên trong khi

ELISA gián tiếp sử
dụng cả kháng thể
chính và phụ.

Gián tiếp
ELISA có thể được
thực hiện bằng hai
loại kháng thể là;
kháng thể sơ cấp và
kháng thể thứ cấp.
Công cụ ELISA
gián tiếp sử dụng cả
hai loại kháng thể
để khuếch đại tín
hiệu để phát hiện tốt
hơn.
kháng nguyên
1. Các đĩa giếng
(Antigen- Ag) được được ủ với kháng
hấp phụ lên một tấm nguyên, rửa và khóa

Mức độ lan xa hay
gần tùy theo lồi
Có tiêm mao


Độ nhạy

Thời gian
Sử dụng kháng thể

Liên kết với
enzyme
Phản ứng chéo của

nhựa, sau đó một
lượng lớn của một
loại protein (thường
là albumin huyết
thanh bị- BSA)
được thêm vào để
khóa tất cả các vị trí
liên kết khác. Trong
lúc đó, một loại
enzyme sẽ liên kết
với một kháng thể
trong một phản ứng
riêng biệt, phức hợp
enzyme- kháng thể
này được sử dụng
để hấp phụ các
kháng nguyên. Sau
khi phức enzymekháng thể dư thừa bị
loại bỏ hết, phức
hợp enzyme- kháng
thể nào gắn với
kháng nguyên
sẽ còn lại trên
giếng. Bằng cách
thêm vào cơ chất

của enzyme, tín hiệu
phát ra đại diện cho
lượng kháng nguyên
trong mẫu.
Xét nghiệm ELISA
trực tiếp chỉ sử dụng
kháng thể chính để
phát hiện kháng
nguyên trong khi
ELISA gián tiếp sử
dụng cả kháng thể
chính và phụ.
Nhanh chóng
Chỉ một loại kháng
thể (Kháng thể
chính) được sử dụng
trong ELISA trực
tiếp.
Các kháng thể sơ
cấp được liên kết
với các enzym.
loại bỏ phản ứng

bằng BSA.
2. Thêm mẫu và
kháng thể vào và
rửa.
3. Enzyme gắn với
kháng thể thứ cấp
được thêm vào và

rửa.
4. Thêm cơ chất,
enzyme trên kháng
thể tạo ra tín hiệu
màu hoặc huỳnh
quang.

Nhạy hơn trực tiếp

Tốn nhiều thời gian
Các kháng thể sơ
cấp và thứ cấp được
sử dụng cho ELISA
gián tiếp.
Các kháng thể thứ
cấp được liên kết
với các enzym.
bị ảnh hưởng với


các kháng thể thứ
hai

chéo của kháng thể
thứ hai.

Tín hiệu

Yếu hơn gián tiếp

phản ứng chéo của
các kháng thể thứ
hai.
được khuếch đại
nên dễ phát hiện

Nguyên lý của kỹ thuật Elisa
Kỹ thuật Elisa là một phương pháp sinh hoá sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự
hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu; Elisa là một cơng cụ chẩn đốn y
học, bệnh lý học thực vật, kiểm sốt chất lượng các ngành cơng nghiệp khác nhau.

Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể và gồm các bước cơ
bản sau:
Kháng nguyên – antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt.
Kháng thể – antibody (KT) biết trước được “rửa” qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với
ezyme.
Thêm vào một cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định
được.
Các phương pháp ELISA
Có ba phương pháp:
1. Phương pháp ELISA trực tiếp:
Sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất enzyme sẽ liên kết trực tiếp với kháng nguyên trên bề mặt đĩa
phản ứng.
 Ưu điểm
Nhanh, vì chỉ sử dụng một kháng thể có gắn cơ chất à hạn chế tối đa các thao tác khi thực hiện phản
ứng.
Loại bỏ được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp.
 Nhược điểm
Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể bị ảnh hưởng xấu bởi enzyme hoặc cơ chất gắn,
Khó khăn và tốn kém trong việc lựa chọn kháng thể cho phản ứng.

Khơng
linh
hoạt
trong
việc
lựa
chọn
các
cơ
chất
gắn.
Tín hiệu khuếch đại thu được thấp.


2. Phương pháp ELISA gián tiếp
Trong phương pháp này, một kháng thể thứ cấp sẽ được bổ sung và bắt cặp đặc hiệu với kháng thể sơ
cấp đã bắt cặp với kháng nguyên. Kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất sẽ phát tín hiệu khuếch đại khi
xảy ra phản ứng bắt cặp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu.
 Ưu điểm
Linh hoạt trong việc sử dụng các kháng thể thứ cấp có gắn cơ chất.
Linh hoạt và dễ dàng trong việc lựa chọn kháng thể sơ cấp cho phản ứng.
Hoạt động miễn dịch của kháng thể sơ cấp có thể phát huy tối đa vì khơng bị ảnh hưởng bởi cơ chất
đánh
dấu.
Độ
nhạy
cao.
Linh hoạt trong việc sử dụng cơ chất.
 Nhược điểm
Có thể xảy ra phản ứng chéo với các kháng thể thứ cấp à độ đặc hiệu của phản ứng bị ảnh hưởng.

Thời gian thực hiện phản ứng lâu hơn.
Phương pháp ELISA “Sandwwich”
Một kháng thể gắn sẽ được sử dụng để gắn với kháng thể sơ cấp, tiếp theo kháng thể thứ cấp có gắn
cơ chất enzyme được bổ sung để bắt cặp với kháng thể thứ cấp trong phản ứng. Tín hiệu khuếch đại
thu được khi có sự bắt cặp kháng ngun – kháng thể đặc hiệu.
 Ưu điểm
Mẫu
khơng
cần
Độ
Thích
hợp
Linh hoạt và độ nhạy cao.

tinh
đặc
cho

sạch
các

trước
hiệu
mẫu

khi

phân
phức

tích.
cao
tạp.

Ứng dụng
Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nơng nghiệp và
đặc biệt trong các quy trình kiểm tra chất lượng các sản phẩm sinh học.
Trong
thực
phẩm
Kỹ thuật ELISA có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau
khi
tăng
sinh.
Phát
hiện
độc
tố
trong
tảo
Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonell, Staphylococcus aureus, sán lá gan,.. trong thực phẩm.
Phát hiện chất chloramphenicol trong tôm, cá và cá sản phẩm thuỷ sản
Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu,…


Trong
y
học
Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát hiện kháng nguyên p24.
Chẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C, bệnh ung thư.

Ứng
dụng
để
phát
hiện
bệnh
A.cantonensis
(bệnh
viêm
màng
não)
Xác định tỷ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung – Tây Ngun.
Trong
nơng
nghiệp
Chẩn đốn bệnh Tristeza (tác nhân gây bệnh héo rũ) trên cây cam quýt.
Giám
định
sự
hiện
diện
của
BBTV
gây
bệnh
chùn
đọt
ở
chuối.
Phát

hiện
kháng
thể
chống
Mycoplasma
hyopnewmonia
(ML)
ở
heo.
Giám định bệnh lùn xoắn lá ở lúa bằng phương pháp DAS ELISA cải tiến.
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn
dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu
giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất
thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một
chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng
nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein,
antibodies, hormone,… Đôi khi nó cịn được gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme
ImmunoAssay)
Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ
rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ
thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác
định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu;
thực hiện qua hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thơng qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ
H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí
nghiệm.

(Trích từ Chemicon International)
2. Phân

loại

ELISA

2.1. Direct ELISA (ELISA trực tiếp)
Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần
phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất
(kháng thể này đã được gắn enzyme).

Sơ đồ 2.1: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA trực tiếp
-

Ưu

điểm:

Đơn
Nhược

giản

nhất
điểm:


+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng ngun có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng

nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope.
+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng.
2.2. ELISA gián tiếp
Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng ngun khơng được
gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể
được
gắn
với
enzyme).

Sơ đồ 2.2: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp
- Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện
lợi
và
kinh
tế
hơn,
dễ
dàng
thương
mại
hóa.
- Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác
nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết
quả có thể tin tưởng được.
2.3. Sandwich ELISA
Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và
nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thơng qua sự kết hợp của hai
loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ
thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody

sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich).
DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng). Những kháng thể này sau
đó kết hợp với các kháng nguyên được thêm vào. Những kháng nguyên được pha loãng trong
blocking buffer nhằm ngăn sự dính khơng chun biệt của chúng vào pha rắn. Ở đây, những phần của
blocking buffer khơng nên chứa bất kỳ kháng ngun nào mà có thể kết hợp với kháng thể bắt. Sau
khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn.


Kháng thể bắt sau đó được thêm vào. Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích và
kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về nguồn động vật hay
loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy đo quang phổ. Vì
sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và những
thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới hạn sự linh hoạt của phương pháp, ví dụ
như mỗi kháng thể được sử dụng phải được đánh dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau).
Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ
kháng ngun phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với
kháng nguyên.
Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác nhau trên phức
hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử
dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát
hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện. Kích thước và
mối quan hệ khơng gian của các epitope trên kháng ngun đích là rất quan trọng và có thể ảnh hưởng
mạnh đến thử nghiệm.
Sandwich ELISA có thể được chia làm hai hệ thống:
2.3.1

Sandwich

ELISA

trực

tiếp

Sơ đồ 2.3: Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp
- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và
kháng
thể
phát
hiện
khác
nhau.
- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn phương pháp
này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu.
Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự
giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thước và vị trí khơng gian của các
epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm.


2.3.2

Sandwich

ELISA

gián

tiếp

Sơ đồ 2.4: Tiến trình thực hiện phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp

Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme không phản ứng
với kháng thể bắt kháng nguyên.
2.4. Phản ứng ức chế /cạnh tranh
Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa là hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ ba.
Phản ứng cạnh tranh đúng đắn thì hai chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời.
Sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh. Cả hai phản ứng đều có sự tham gia của hai kháng thể phản
ứng với kháng nguyên. Nếu một kháng thể được ủ trước phản ứng đó được gọi là ức chế (blocking/
inhibition assays). Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa cả hai kháng thể được thêm vàođồng thời với
nhau (hình 1).


Hình 1 : sự khác biệt giữa ức chế và cạnh tranh
2.4.1. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên
Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên được mô tả ở sơ đồ 2.5
Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên trên bề mặt đĩa và lượng kháng thể gắn enzyme đã
được chuẩn độ để tối ưu. Kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme được thêm vào đĩa cùng một lúc để
tạo ưu thế cạnh tranh.
Nếu kháng nguyên tương tự hoặc cùng như kháng nguyên đã được gắn trên đĩa thì kháng thể gắn
enzyme sẽ gắn lên kháng nguyên này. Khi nồng độ của kháng nguyên cạnh tranh cao sẽ ngăn cản bất
kỳ sự kết hợp của kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên trên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%). Nếu
nồng độ kháng ngun cạnh tranh giảm (ví dụ : pha lỗng) sự cạnh tranh sẽ giảm. Như vậy nồng độ
kháng nguyên cạnh tranh càng cao thì độ hấp thu màu càng giảm.
Kháng nguyên cạnh tranh có thể được thêm trực tiếp vào đĩa nếu nó được pha lỗng trong blocking
buffer trước khi thêm kháng thể gắn enzyme.
Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan của nồng độ phân tử cần kiểm tra và
kháng nguyên trên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng của kháng nguyên).
Sau khi ủ và rửa, lượng kháng thể được đánh dấu được định lượng sau khi thêm cơ chất. khi khơng có
kháng ngun trong mẫu kiểm tra hay khơng có sự tương đồng của kháng ngun thì khơng có sự gắn

kết với kháng ngun được đánh dấu và khơng có sự cạnh tranh với kháng nguyên này. Kết quả là
mẫu có chứa kháng ngun thì sự cạnh tranh làm giảm cường độ màu cịn đối chứng âm thì khơng.

Sơ đồ 2.5. Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên
2.4.2. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể
Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể được mô tả chi tiết ở sơ đồ 2.6.
Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể. Sự cạnh tranh ở
đây là giữa kháng thể trong mẫu và kháng thể được đánh dẫu với các vị trí trên kháng nguyên trên đĩa.
Mẫu và kháng thể đánh dấu được trộn với nhau trước khi thêm vào đĩa.


Sơ đồ 2.6. Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể
3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA
Số
lượng
kháng
thể
thứ
nhất
được
gắn
vào
đáy
Ái
lực
của
kháng
thể
thứ
nhất

đối
với
kháng
- Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên

giếng
nguyên

4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA


Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ
kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.

 Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả
hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản
 Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại
kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu.


 Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng khơng tạo màu với đối chứng dương thì có thể kiểm tra lại
nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.
 Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí
nghiệm.

Thành phần các mơi trường

Mơi trường
SPW
BPW

LBS
BGBL
EC
Mt canh Trypton
TSA
VRBG
MSB
BPA
BHI
Bile Esculin
Azide glucose
TCBS
SDB
PDA
MEA
DG 18
XLD
KIA
TSI
MYP
HE
MKTTn
RVS

Thành phần
NaCl, peptone, nước cất
NaCl, peptone, nước cất
Trypton, lactose, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, Sodium lauryl sulfate, nước cất
pH cuối 6,8±0,2
Peptone, lactose, mật bò, brilliant green, nước cất pH 7,2±0,2

Trypton, muối mật, lactose, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, nước cất, pH 6,9±0,2
Trypton, nước cất, pH 6,9±0,2
Tryptocase pepton, phytone pepton, naCl, agar, nước cất pH 7,3±0,2
Cao nấm men, pepton, NaCl, muối mật, lactose, neutral red, crystal violet,
agar, nước cất, pH 7,4±0,2
Cao thịt, polypeptone, NaCl, mannitol, phenol red, nước cất, pH 7,4±0,2
Trypton, cao thịt, cao nấm men, sodium pyruvate, glycine, lithium chloride,
agar
Dịch não dê, dịch tim bò, polypepton, NaCl, Na2HPO4, dextrose, nước cất
Cao thịt, pepton, esculine, oxgall, Re citrate, agar, nước cất, pH 6,6±0,2
Trypton, dextrose, K2HPO4,KH2PO4, NaCl, sodium azide, bromocresol
purple, nước cất, pH 6,9±0,2
Cao nấm men, sucrose, sodium thiosulfate, sodium citrate, oxgall, NaCl, Fe
citrate, bromothymol blue, thymol blue, agar, nước cất
Polypepton, dextrose, nước cất
Khoai tây, dextrose, agar, nước cất
Cao malt, agar, nước cất
Glucose, pepton, KH2PO4, MgSO4, dichloran (0,2% trong etanol), glycerol,
agar, choramphenicol, nước cất
Natri desoxycholate, xylose, lactose, sucrose, sắt ammonium citrate, cao
nấm men, L-lysine, sodium thiosulfate, phenol red
Cao thịt, cao nấm men, pepton, protease peptone, NaCl, lactose, glucose, sắt
sulfate, natri thiosulfate, phenol red, agar, nước cất
Lactose, glucose, phenol red
D-mannitol, cao thịt bò, NaCl, pepton từ casein, agar, nước, phenol đỏ,
polymyxin B sunfat, lòng đỏ trứng gà
Cao nấm men, lactose, saccharose, pectic digest of meat, muối mật, NaCl,
natri thiosulfate, Fe ammoinium citrate, bromthymol red, acid fuchsin, agar

Thạch máu
TBX
LDC
TSC
Thioglycolat lỏng

LS
Môi trường nitrate
thử di động
Lactoza-gelatin
TCBS
Thạch glucoza

Pepton proteoza, sp thủy phân gan, cao nấm men, NaCl, agar, nước
Sp thủy phân casein bằng enzyme, muối mật, BCIG, dimethyl sulfoxit, agar,
nước
pectic digest of animal tissue, cáo nấm men, dextrose, l-lysin hydrochlorine,
bromecresol purple, pH 6,8 ±0,2
Tryptose, peptone đậu nành, cao nấm men, sodium metabisulphite, sắt
ammonium citrate, agar, pH 7,6±0,2
Pepton từ casein, L-xystin, D-glucoza, cao nấm men, NaCl, natri thiogly
colat, agar, resazurin, nước

Pepton từ casein, cao nấm men, NaCl, lactoza, l-xystin hydro clorua, nước
Pepton từ casein, cao thịt, galactoza, glycerol, KNO3, Na2HPO4, agar, nước
Pepton từ casein, cao nấm men, lactoza, gelatin, phenol đỏ, nước
Polypepton, cao nấm men, sac, bacteriological ox bile, sodium cholate, sodium
citrate, sodium thiosulfate, NaCl, Fe ammonium citrate, bromthymol blue,
thymol blue, bacteriological agar pH 8,6±0,2
Dịch thủy phân casein bằng enzyme, NaCl. Agar, nước, cao nấm men, glucoza,

bromcresol purple