Sàng lọc một số thực vật có khả năng ức chế enzyme tyrisinase và tối ưu quy trình chiết của thực vật có hoạt tính tốt nhất

I H C QU C GIA TP. HCM
I H C BÁCH KHOA
--------*-------

ÁI XUÂN

SÀNG L C M T S

TH C V T CĨ KH

CH ENZYME TYROSINASE VÀ T
TRÌNH CHI T C A TH C V T CĨ HO T TÍNH
T T NH T
Chuyên ngành: K Thu t Hóa H c
Mã s : 60520301

LU

TP. H

C


ii

-HCM

-


iii

-

-

: 60520301
I.
TÀI : SÀNG L C M T S TH C V T CÓ KH
C CH
ENZYME TYROSINASE VÀ T
T C A TH C V T
CĨ HO T TÍNH T T NH T

rau sam.
II.
III.
IV.

22/02/2021
05/12/2021


i

có th hồn thành lu
th các th

t nghi p, tơi xin g i l i c

n toàn

i h c Bách Khoa-

d tôi trong su t th i gian theo h c t

n tình d y

c bi t, tơi xin g i l i c

n:
TS. Hà C m Anh

ng d n tơi r t t n tình v n i dung nghiên c u,

h tr thao tác thí nghi

ng viên tinh th n tôi r t nhi u trong su t quá trình

th c hi n lu
TS. Lê Xuân Ti
quy n lu

u ý ki

hoàn thành n

t nghi p.

Em Lê Minh T n

ng hành cùng tơi trong q trình th c hi n lu

Các th y cơ khoa K thu t Hóa h c nói chung và b mơn K thu t H
t ki n th
thành lu

n t ng v ng ch

tôi hồn

n th c cho ngh nghi p c a tơi sau này.

Các b n cùng làm thí nghi m lu

i tôi t

s nh ng kinh nghi m và h tr tơi r t nhi u trong su t q trình th c hi n lu n

Cha m và m

d a tinh th n v ng ch c, giúp

tơi có thêm ngh l
M c dù tôi

t quãng th i gian h c t p xa nhà.
g ng r t nhi

kh i nh ng thi u sót. R t mong nh

hồn thi n lu

tránh

c nh ng ý ki

a th y

cô và các b n. Tơi xin chân thành c
Xin kính chúc t t c các th y cô và các b n nh ng l i chúc t

p nh t!

i th c hi n lu

Ái Xuân


ii

Nghiên c

c hi

hóa b máy th c v t c a

ng bao g m

lá tr ng cá, lá gi p cá, lá i, lá ngh , lá rau sam. K t qu cho th

u

có ch a các h p ch t thu c nhóm polyphenol, flavonoid, tannin và alkaloid. K t qu
sàng l c ho t tính c ch enzyme tyrosinase c a

ng cho th y lá ngh có

ho t tính c ch enzyme tyrosinase m nh nh t v i giá tr IC50 = 169,87 µg/mL.
Ngồi ra, lá ngh còn cho th y kh

t v i giá tr IC50 là

10,41 µg/mL, theo sau là lá i, lá tr ng cá lá rau sam và lá gi
u ki n chi t c a m u lá ngh b
m c tiêu là kh

ng theo hàm

c ch enzyme tyrosinase và hàm m

flavonoid t ng. K t qu nghiên c
ngh có kh

m

ra r

ng

u ki n trích ly thích h

c ch enzyme tyrosinase t t nh t là n

lá

ethanol 63%, nhi t

56,5oC, th i gian chi t 13,96 phút và t l r n:l ng 1:8,18 g/mL và giá tr IC50 t i
u ki n trích ly thích h
flavonoid t t nh t là n
t l r n:l ng 1:9,46
Ngoài ra, m u cao t
kh
giá tr IC50 là 6,97 µg/mL.

ethanol 62%, nhi

t qu

ng

53oC, th i gian chi t 60 phút và

ng polyphenol t ng
c ch

lá ngh

m này là 530 mg/g.
c nghiên c u

i


iii

ABSTRACT
Preliminary assessment chemical structure of five materials including Muntingia
calabura L. leaves, Houttuynia cordata Thunb. leaves, Psidium guajava L. Leaves,
Persicaria pulchra (Bl.) Soják leaves, and Portulaca oleracea L leaves were
conducted. Results showed that all of the plants contained the compound of
polyphenol group, flavonoid group, tannin group, and alkaloid group. The result of
screening of tyrosinase inhibitory activity of five plants showed that Persicaria
pulchra (Bl.) Soják leaves had the most potential tyrosinase inhibitory activity with
IC50 value of 169.87µg/mL, followed by Psidium guajava L. leaves, Muntingia
calabura L. leaves, Portulaca oleracea L leaves, and Houttuynia cordata Thunb.
leaves. Moreover, screening four plants for antioxidant activity was also conducted
and results showed that Persicaria pulchra (Bl.) Soják leaves had the best
antioxidant activity compared to the others with IC50 value of 10.41µg/mL. Then,
tyrosinase inhibitory activity and total flavonoid content from Persicaria
pulchra (Bl.) Soják leaves are optimized by response surface methodology.
Research results indicated that the best extraction conditions for tyrosinase
inhibitory activity were extraction solvent of 63% ethanol, temperate extraction of
56.5oC, solid-to-solvent ratio of 1:8.18 g/mL, and extraction time of 13.96 minutes
and the value of IC50 was 112.29 µg/mL. Furthermore, the best extraction
conditions for total flavonoid content were extraction solvent of 62% ethanol,
temperate extraction of 53oC, solid-to-solvent ratio of 1:9.46 g/mL, and extraction
time of 60 minutes, and the value of the total polyphenol content was 530 mg/g.
Additionally, the optimized sample of tyrosinase inhibitory activity was also studied
the antioxidation activity and gave best results with IC50 value of 6.97 µg/mL. that
were equivalent to the antioxidant activity of positive control (Vitamin C).

iv


v

M CL C
............................................................................................................ i
................................................................................................................. ii
ABSTRACT ............................................................................................................. iii
.................................................................................................... iv
M C L C ................................................................................................................. v
................................................................................................. ix
DA

............................................................................................... xii
........................................................................................ xiii

D

................................................................................. xv
................................................................................................. 1
tv

............................................................................................................ 1

1.2. M c tiêu và ph m vi nghiên c u ......................................................................... 2
1.3. C u trúc lu

................................................................................................. 2

2

......................................................................................... 4

2.1

............................................................................... 4

2.1.1. Melanin ....................................................................................................... 4
2.1.2. Enzyme tyrosinase ....................................................................................... 7
2.2. Các h p ch t có kh

c ch enzyme tyrosinase ......................................... 9

2.2.1. Các ch t c ch tyrosinase có ngu n g c t t ng h p ............................... 10
............................. 12
2

ng nghiên c u kh

ng da ................................................... 16

2.4.1. Lá tr ng cá (Muntingia calabura L.

Muntingiaceae) ............................. 17


vi

Houttuynia cordata Thunb.
Psidium guajava L.

Saururaceae) ............................ 18

Myrtaceae) ................................................... 20

Persicaria pulchra (Bl.) Soják

Polygonaceae) ........................ 22

2.4.5. Rau sam (Portulaca oleracea L) ................................................................ 23
3
3.1.

.......................... 25
....................................................................................................... 25

3

.............................................................................. 25
3.2.1. Hóa ch t s d ng ........................................................................................ 25
3.2.2. Thi t b s d ng ......................................................................................... 25

3.3. N i dung th c nghi m ....................................................................................... 26
3.4

................................................................................... 26
......................................................... 26

................................................................................... 27
t cao t ng ........................................................................... 27
th c v t ........................................................................... 28

AlCl3 ......................................................................................................................... 29
t tính c ch enzyme tyrosinase ........................... 31
3.3.8.

........................ 33
ng b m
4

ng (RSM). .................................. 34
....................................................... 38

4.1. Chu n b nguyên li u ......................................................................................... 38
4.2. Hi u su t thu cao t ng ....................................................................................... 39


vii

4.3. K t qu ho
4.4.

...................................................................................... 41

ng flavonoid t ng ................................................................................ 43

4.5. Kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase.................................................... 44
4.6. Kh o sát ho t tính kháng oxy hóa ..................................................................... 46

u ki n trích ly thích h
tyrosinase b

m

t

t tính c ch enzyme

ng (RSM) ............................................. 47

nh vùng kh o sát c a y u t n

c n ............................................ 48

nh vùng kh o sát c a y u t nhi t

................................................... 50

nh vùng kh o sát c a y u t t l r n-l ng ........................................... 51
nh vùng kh o sát c a y u t th i gian chi t ......................................... 52
4.7.5. Mã hóa vùng kh o sát và k ho ch thí nghi m .............................................. 53
4.8. K t qu các thí nghi m quy ho ch và phân tích t

t tính c ch

enzyme tyrosinase..................................................................................................... 54
4.8.1. K t qu các thí nghi m quy ho ch ................................................................. 54
4.8.2. Phân tích s

a mơ hình và th c nghi m .................................... 57

nh m
4.8.4. D

t
mt

ng b m t ....................................... 60
....................................................................................... 62

4.9. K t qu các thí nghi m quy ho ch và phân tích t

ng flavonoid

.................................................................................................................................. 63
4.9.1. K t qu các thí nghi m quy ho ch ................................................................. 63
t qu ......................................................................... 66
4.9.3. D

mt

....................................................................................... 69
c ch enzyme tyrosinase c a m u cao t

ch enzyme tyrosinase và m u cao t

t tính c

ng favonoid ........................ 70

viii

t tính kháng oxy hóa c a m u cao t

.................................. 71

5. K T LU N VÀ KI N NGH ............................................................. 73
DANH M C CÁC CÔNG B

KHOA H

....76

TÀI LI U THAM KH O ..................................................................................... 76
PH L C ................................................................................................................ 89
LÝ L


ix

Hình 2. 1. C u trúc c a melanin ................................................................................. 4
Hình 2. 2. B

phân b màu da trên th gi i ......................................................... 5

Hình 2. 3.

....................................................... 6

Hình 2. 4. C u trúc enzyme tyrosinase
Hình 2. 5.

m

t bào [23] ............................... 7

ng liên k t v i histamin trong vùng ho

ng c a tyrosinase [23] ..... 8

Hình 2. 6. Q trình oxy hóa phenol v i xúc tác c a enzyme tyrosinase .................. 8
Hình 2. 7. Các d ng oxi hóa c a enzyme tyrosinase .................................................. 9
Hình 2. 8. C u trúc N-hydroxy-

-phenylurea và N-phenylthiourea ...................... 10

Hình 2. 9. C u trúc c a tropolon và 4-hexylresorcinol ............................................ 11
Hình 2. 10. C u trúc c a captopril, penicillamin và methimazol ............................. 12
Hình 2. 11. M t s h p ch t thu c nhóm flavonoid ................................................. 13
Hình 2. 12. M t s h p ch t thu c nhóm Aldehyde ................................................ 14
Hình 2. 13. C u trúc c a azelaic acid (dicacboxylic acid) ....................................... 15
Hình 2. 14. C u trúc c a kojic acid .......................................................................... 16
Hình 2. 15. Cây tr ng cá........................................................................................... 17
Hình 2. 16.

............................................................................................ 19

Hình 2. 17.

........................................... 20

Hình 2. 18.

....................................................................................................... 20

Hình 2. 19.

.................................................................................................. 22

Hình 2. 20. Lá rau sam ............................................................................................. 23
Hình 3. 1.

quy trình chi t cao c

Hình 3. 2. Quy trình l

ng nghiên c u ........................ 28

ng chu n quercetin ...................................................... 30


x

Hình 3. 3.
Hình 3. 4.

ng flavonoid c a m u ................................................ 30
th

h p thu c a quercetin ............................................................... 31

Hình 3. 5.

.......................... 32

Hình 3. 6. Ph n ng c a g c t do DPPH và ch t ch ng oxy hóa ........................... 33
Hình 3. 7. Quy trình kh o sát ho t tính kháng oxy hóa ............................................ 34
Hình 4.1. B t sau khi xay (a) b t lá tr ng cá, (b) b t lá gi p cá, (c) b t lá i, (d)
b t lá ngh , (e) b lá rau sam. ................................................................................ 38
Hình 4. 2. Hi u su t thu cao t ng c

ng kh o sát ................................. 40

Hình 4. 3. M t s h p ch t thu c nhóm alkaloid và flavonoid ................................ 42
Hình 4. 4. C u trúc m t s nhóm ch t c a flavonoid ............................................... 43
Hình 4. 5.
Hình 4. 6. Kh
Hình 4. 7. Kh
Hình 4. 8. Kh

ng flavonoid t ng c
c ch enzyme tyrosinase c

ng nghiên c u ...................... 44
ng kh o sát ............ 45
ng kh o sát. ............................ 47

c ch enzyme tyrosinase và TFE c a các m u cao

n

c n khác nhau ........................................................................................................... 49
Hình 4. 9. Kh
nhi

c ch enzyme tyrosinase và TFE c a các m u cao chi t

khác nhau .................................................................................................... 50

Hình 4. 10. Kh

c ch enzyme tyrosinase và TFE c a các m u cao chi t

t

l r n-l ng khác nhau ............................................................................................... 52
Hình 4. 11. Kh

c ch enzyme tyrosinase và TFE c a các m u cao chi t

th i gian khác nhau................................................................................................... 53
Hình 4. 12. Mơ hình quy ho ch th c nghi m ........................................................... 55
Hình 4. 13. Kh
Hình 4. 14. B m

c ch enzyme tyrosinase c a các thí nghi m quy ho ch..... 57
ng c a quy ho ch t i th i gian chi t 10 phút ................... 61

xi

Hình 4. 15. B m

ng c a quy ho ch t i th i gian chi t 15 phút ................... 61

Hình 4. 16. B m

ng c a quy ho ch t i th i gian chi t 20 phút .................. 62

Hình 4. 17. K t qu

ng TFE c a các thí nghi m quy ho ch......... 66

Hình 4. 18. B m

ng c a quy ho ch t i t l n

là 50% ...................... 69

Hình 4. 19. B m

ng c a quy ho ch t i t l n

là 65% ....................... 69

Hình 4. 20. Kh

c ch enzyme tyrosinase c a các m u cao .......................... 70

xii

DA
B ng 3. 1.

ng nghiên c u ....................................................................... 25

B ng 3. 2. Các thông s kh o sát vùng quy ho ch ................................................... 35
B ng 3. 3.
B ng 4. 1

a mơ hình và th c nghi m ....................... 36
tro tồn ph n c a các m

B ng 4. 2. K t qu
B ng 4. 3. Kh

c li u sau khi s y .............. 39

th c v t c a các cao chi t ................................................ 41
c ch enzyme tyrosinase

n

1000 µg/mL. ................ 45

B ng 4. 4. Liên h gi a bi n mã hóa và bi n th c ................................................... 54
B ng 4. 5. B ng quy ho ch th c nghi m.................................................................. 56

B ng 4. 6. B ng phân tích s phù h p c a th ng kê ................................................ 58
B ng 4. 7. B ng phân tích h s c
B ng 4. 8. Thí nghi m ki

i quy ..................................... 59
mt

............................................................ 63

B ng 4. 9. K t qu quy ho ch th c nghi m ............................................................. 65
B ng 4. 10. B ng phân tích s phù h p c a th ng kê .............................................. 66
B ng 4. 11. B ng phân tích h s c

i quy ................................... 67

B ng 4. 12. K t qu ki m tra th c nghi m c a m u cao t

............................... 70

B ng 4. 13. K t qu kh sát ho t tính kháng oxy hóa .............................................. 71


xiii

Ph l

mc

ng nghiên c u ...................................................... 89

Ph L

tro toàn ph n c

Ph L c 3. Hi u su t thu cao t ng c

ng nghiên c u .................................... 89
ng nghiên c u ........................... 89

Ph L c 4. K t qu

th c v t c a các m u cao tr ng cá .................................. 91

Ph L c 5. K t qu

th c v t c a m u cao gi p cá .......................................... 92

Ph L c 6. K t qu

th c v t c a m u cao i .................................................. 93

Ph L c 7. K t qu

th c v t c a m u cao ngh .............................................. 94

Ph L c 8. K t qu

ng flavonoid t ng c a các m

c li u ................... 95

Ph l c 9. K t qu kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase c

ng

nghiên c u ................................................................................................................ 96
Ph l c 10. K t qu kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase c a kojic acid... 97
Ph L c 11. K t qu kh o sát ho t tính kháng oxy hóa c

ng nghiên c u

.................................................................................................................................. 97
Ph L c 12. K t qu kh o sát ho t tính kháng oxy hóa c a vitamin C.................... 99
Ph L c 13. K t qu kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase

các n

c n

.................................................................................................................................. 99
Ph l c 14. K t qu kh

ng TPE và TFE theo t ng n

Ph l c 15. K t qu kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase
Ph l c 16. K t qu kh

ng TPE và TFE theo các nhi

Ph l c 17. K t qu kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase

c n ...... 100
các nhi

. 100

............... 102
các t l r n-l ng

................................................................................................................................ 103
Ph l c 18. K t qu kh

ng TPE và TFE theo t l r n-l ng ............. 104


xiv

Ph l c 19. K t qu kh o sát ho t tính c ch enzyme tyrosinase

các th i gian

chi t ........................................................................................................................ 104
Ph l c 20. K t qu kh
Ph l c 21. K t qu

ng TPE và TFE theo th i gian chi t ........... 106

c ch enzyme tyrosinase c a các thí nghi m quy ho ch ..... 106

xv

D
DMSO

Dimethylsulfoxide

EtOH

Ethanol

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

HQ

Hidroquinone

FDA

Food and Drug Administration

USD

United States dollar

TPE

Total polyphenol excretion

TFE

Total flavonoid excretion

PPO

Polyphenol oxidase

Dopa

3,4-dihydroxyphenylalanine

DHICA
DHI

Dihydroxylindole-2-carbonxylic acid
Dihydroxyindole


1

tv
Theo báo cáo c a Hi p h i Tinh d uc a tr

u-M ph m Vi t Nam ch tính riêng

ng m ph m Vi

USD [1].

ng 80% là các s n ph m làm tr

c tính c a

Global Industry Analysts giá tr các s n ph m làm tr ng da (Skin lighteners) trên th
gi i s

t kho ng 31,2 t

[2]. V i nh ng s li

minh r ng ngành công nghi p m ph

ng

c bi t là m ph m làm tr ng

da nói riêng là m t ngành vô cùng ti
c u.
Tùy thu c vào s

ng c a da v i nh

mà có th áp d

t. Khơng nh ng th khi mà khoa h c k

thu t ngày càng phát tri n hi
hàng m ph

d

ng da khác nhau

i vi c làm tr ng da khơng cịn là ch s d ng các m t
c ng d ng thêm r t nhi u các công ngh tiên ti n có tác

u tr

tr trong vi c làm tr

mà các

c phân thành hai lo
c. Tuy nhiên, v
này là vi c t n t i nhi u r i ro
Hi n nay, h u h

ng g p ph i
ng không t

nh

n s c kh

i s d ng,...

u tr tr ng da ch y u s d

chính là

c ch ho t tính c a enzyme tyrosinase.
ch t làm tr ng da có ngu n g c t thiên nhiên kh
tyrosinase là

pháp v t lý

ng chung không ch c

c nghiên c u và phát tri n các ho t
c ch ho t tính c a enzyme
i tiêu dùng mà còn t r t nhi u nhãn

hàng m ph m trên th gi i. Do tính an tồn, d s d ng t i nhà, giá c h p lý, ngu n
nguyên li u có s n trong t nhiên,.... th nên vi c l a ch n các th c v
trong ngành công nghi p m ph m không ch
c

s d ng

ng mà còn là nhu c u c n thi t

i.
V i l i th v th m th c v t phong phú, Vi

gian v nh ng th

c có kh

i khác. Tuy nhiên, nh ng bài thu

t nhi u bài thu c dân
n ph bi n t

i này

c xác nh n và ki m ch ng.


2

Th nên vi c nghiên c u nh ng th
vi c làm b t nh

c có kh

ng da khơng ch là m t

ng chung c a th gi i mà còn là m t v

c n thi t.

da

1.2. M c tiêu, ph

ng nghiên c u

+ M c tiêu chính c a nghiên c u này là sàng l c m t s th c v t
Vi t Nam có kh

ng da thơng qua kh

Th c v t có kh

c ch enzyme tyrosinase.

c ch enzyme tyrosinase t t nh

u ki n chi t b

c thu hái

c ti p t c ti n hành t

m

t

t tính c a

nó.
+ Ph m vi nghiên c u bao g m:
-

lá tr ng cá, lá gi p cá, lá

i, lá ngh , lá rau sam.
-

(Muntingia calabura L.), lá g

(Houttuynia cordata Thunb.), lá

i ( Psidium guajava L.), lá ngh ( Persicaria pulchra (Bl.) Soják), lá sam (Portulaca
oleracea L).
1.3. C u trúc lu
Lu

c chia l m 2 ph n ch nh bao g m ph

qu tr nh nghiên c
nghiên c

l thuy

ph n c c k t qu th c hi
ng quan, c c nguyên l v l thuy

ng da, c ch enzyme tyrosinase và các lo

c li

n

c trong qu tr nh
n kh
c th hi n

3

trong lu

n k t qu

c

us
uv

c tr nh b y trong

p

t qu và

bàn lu n. Ph n k t lu n v ki n ngh c a nh m nghiên c u s

c tr nh b y trong

, c c thông s th nghi m, c c thông tin b
k t qu s
n y.

c th hi n trong ph n Ph L

nh k m theo báo cáo lu

n

4

2
2.1
2.1.1. Melanin
Melanin (Hình 2.1
nhiên [10]

[11].

Hình 2. 1. C u trúc c a melanin
Hình 2.2
hemoglobin [12]
[13]


5

Hình 2. 2. B

phân b màu da trên th gi i

[14]

[15,
16]

[17]

[18]
-Mason (Hình 2.3)


6

[16]

[19] và
[19].

[20]

Hình 2. 3.
Theo quá trình Raper-Mason (Hình 2.3

-

tyrosinase [21]

-2dopaqu

vàng-

[22].


7

2.1.2. Enzyme tyrosinase
Tyrosinase (Hình 2.4) hay cịn g i là enzyme polyphenol oxidase (PPO), là m t
enzyme monooxygenase có ch

ng trong phân t .

Hình 2. 4. C u trúc enzyme tyrosinase
Trung tâm ho

ng hay vùng ho

m

t bào [23]

ng (active site) c a enzyme có 3 nguyên t

ng trong vi c xúc tác c
ng t o liên k t ph i trí v i 3 phân t histamin (Hình 2.5). Ngồi ra vùng ho
c hình thành t các chu
Asn260

[24].

ng

Val283, Phel264, His244, Val248,